Es la región que contiene el ADN en los procariotas.
Los microorganismos han proporcionado sistemas poderosos para comprender los principios básicos de la organización, dinámica y función de los cromosomas, comenzando con la hipótesis del replicón.
Durante la última década, se han agregado análisis de imágenes cada vez más sofisticados desde las perspectivas físicas a las herramientas más tradicionales proporcionadas por la bioquímica, la genética y la biología molecular.
Un desafío importante para la investigación actual es integrar todas estas consideraciones para proporcionar una visión más profunda y unificada.
El nucleoide
El nucleoide es el espacio dentro de una célula procariótica donde se encuentra la información genética, llamada genóforo. Los procariotas se dividen en bacterias y arqueas, que son organismos unicelulares que no contienen orgánulos unidos a la membrana.
El nucleoide, entonces, tampoco tiene membrana a su alrededor. Se adhiere a la membrana celular y en contacto inmediato con el citoplasma.
El nucleoide tampoco tiene una forma uniforme y no tiene un tamaño específico. Sin embargo, aún podemos distinguirlo del resto de la célula e identificarlo bajo un microscopio de luz.
El nucleoide está compuesto principalmente de múltiples copias compactadas de ADN en un hilo continuo, con la adición de algunos ARN y proteínas. El ADN en procariotas es de doble cadena y generalmente toma una forma circular.
Tenga en cuenta que a veces también se puede encontrar ADN en otras regiones fuera del nucleoide. Para poner las cosas en perspectiva, podemos observar la contraparte eucariota del nucleoide.
Los eucariotas, como las plantas y los animales, tienen un núcleo que alberga su material genético, con una doble membrana circundante, o lo que llamamos la envoltura nuclear.
Esta membrana separa los contenidos del núcleo del citoplasma. Al igual que en los procariotas, el ADN de los eucariotas también es de doble cadena.
En bacterias
Un avance importante en los últimos años ha sido la apreciación de que el ADN circular del cromosoma bacteriano, denominado «nucleoide», es un objeto físico discreto y bien definido.
Las imágenes de fluorescencia recientes de células vivas y el análisis de captura de cromosomas de células fijas revelan formas discretas con subestructura longitudinal definida.
Dichos hallazgos confirman y extienden los hallazgos anteriores del análisis de imágenes y ponen en reposo los modelos en los que el nucleoide comprende una fibra orientada al azar, ya sea lineal o topológicamente ramificada, que llena el espacio celular disponible.
Los nucleósidos se preparan a partir de plastos aislados solubilizando la envoltura y las membranas tilacoides. Se han utilizado diversos detergentes no iónicos, así como diversos medios de gradiente de densidad.
Sin embargo, la mejora más importante fue el uso del llamado tampón «TAN» inventado por el grupo de Kuroiwa. «TAN» era el nombre de un investigador que lo utilizó por primera vez en su laboratorio.
El tampón TAN consta de sacarosa 0,5 M, espermidina 1,2 mM, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y clorhidrato de trisaminometano 20 mM (Tris HCL) (pH 7,5). La sacarosa y la espermidina son altamente efectivas para estabilizar la estructura compacta de los nucleoides.
La baja fuerza iónica y la quelación de los cationes divalentes con el ácido etilendiaminotetraacético son esenciales para mantener los nucleoides en un estado altamente condensado.
La adición de cloruro de sodio (NaCl) a una concentración por encima de 0.2 M o varios cloruro de magnesio milimolar (MgCl2) libera proteínas principales de unión al ADN de los nucleósidos.
La espermidina es un miembro de las poliaminas naturales, que están presentes en los cloroplastos, así como en las células bacterianas o eucariotas y son importantes para mantener la actividad adecuada de la expresión génica.
Sin embargo, la espermidina no debe agregarse en el tampón durante el aislamiento de los plástidos por el gradiente de densidad de Percoll, ya que se une a la superficie cargada negativamente de Percoll.
Un método simple y conveniente para preparar nucleoides a partir de plastos consiste en:
La solubilización de plastos con Nonidet P-40, la centrifugación a baja velocidad y la filtración a través de un filtro de membrana para eliminar los contaminantes a granel (almidón, fragmentos de núcleos celulares, cutículas y otros materiales insolubles), y sedimentación de nucleoides por centrifugación de alta velocidad.
El uso de la centrifugación con gradiente de densidad a través de metrizamida o sacarosa es eficaz en la purificación de los nucleoides en cierta medida, pero la efectividad del gradiente de densidad está limitada por el hecho de que los nucleoides son muy heterogéneos con respecto a la densidad de flotación.
Desafortunadamente, incluso la más pura de las preparaciones de plastid actualmente disponibles contiene varias proteínas hidrófobas que no se cree que sean verdaderos constituyentes de los nucleósidos.
Aunque las preparaciones de nucleoides aisladas parecen muy puras por inspección con un microscopio de fluorescencia después de teñirlas con fluorocromo DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol), varias proteínas hidrófobas que se originan en varias membranas celulares se adhieren a la preparación de nucleoide.
Como lo demuestra la microsecuenciación de Bandas de proteínas representativas de los nucleoides.
Esta puede ser una razón por la cual no se ha realizado un análisis proteómico exhaustivo de los nucleósidos plástidos. Actualmente, los componentes importantes se identifican uno por uno por medios bioquímicos y biológicos moleculares.
Se identifican diversas proteínas de unión al ADN mediante experimentos de «reconstitución» en los que una proteína sobreexpresada en células de Escherichia coli y altamente purificada a partir de ellas se mezcla con el ADN purificado para ver la formación de estructuras particuladas que se parecen a los nucleósidos bajo microscopía.
Otro método es usar DAPI como una sonda fluorescente para monitorear la condensación del ADN. Este método se basa en los cambios en la extinción de la fluorescencia causados por la condensación del ADN y el fluorocromo.
El efecto de la adición de proteínas nucleoides, que están sobreexpresadas en células de E. coli, sobre la actividad de transcripción de los nucleoides es un buen criterio para identificar componentes funcionalmente importantes de los nucleoides, un enfoque que complementa el análisis bioquímico.
La composición de las proteínas de los nucleoides aislados de varias plantas y órganos diferentes se ha informado.
Se describen los cambios en la composición de la proteína o en la actividad de transcripción durante el desarrollo de cloroplastos, cromoplastos, proplastidos y amiloplastos.
Se han comparado los nucleósidos de etioplastos y cloroplastos en pepinos y guisantes.
La composición proteica es en su mayoría idéntica en etioplastos y cloroplastos de cotiledones de pepino, mientras que los nucleoleos de etioplastos y cloroplastos en hojas de guisante contenían proteínas cualitativamente y cuantitativamente diferentes.
Los etioplastos de los cotiledones de pepino son grandes y contienen cuerpos prolamelares altamente desarrollados, listos para convertirse en cloroplastos poco después del inicio de la iluminación (alrededor de 3 a 6 h).
Mientras que los etioplastos de las hojas de guisante son pequeños y comienzan a desarrollarse por largo tiempo (más de 24 h) después del inicio de la iluminación.
Esto sugiere que la composición de los nucleoides está determinada no solo por el estado de enverdecimiento, sino por el estado de desarrollo global del plástido.
Estructura nuclear y replicación del cromosoma
La característica central del metabolismo de los ácidos nucleicos bacterianos es el nucleoide, una región citoplásmica que está tan densamente llena de material nuclear que excluye los ribosomas y se puede ver fácilmente en micrografías electrónicas.
El nucleoide generalmente ocupa alrededor del 10% del volumen celular. El nucleoide no está encerrado por una membrana nuclear como se encuentra en los eucariotas, lo que tiene consecuencias significativas para el organismo.
El nucleoide está compuesto por aproximadamente 60% de ADN, 30% de ARN y 10% de proteínas. El cromosoma, compuesto de ADN, es la molécula predominante en el nucleoide.
Por lo general, hay un cromosoma de aproximadamente 1 mm de longitud, con un tamaño típico de genoma procariótico del orden de 1.9 a 6.3 x 106 pares de bases.
Este ADN es una molécula de doble cadena, circular cerrada covalentemente (generalmente) y superenrollada.
Existen varias especies de microorganismos procarióticos que tienen cromosomas lineales, y algunas especies tienen dos o tres cromosomas.
Teniendo en cuenta el gran tamaño del cromosoma, no es de extrañar que deba compactarse para que quepa en la célula bacteriana. Como no hay una membrana nuclear, el ARN y la proteína mantienen la estructura nuclear compacta.
El cromosoma existe como 50–100 dominios enrollados por separado que se pueden relajar individualmente para la replicación, reparación y expresión génica.
El superenrollamiento se mantiene mediante enzimas topoisomerasas, como la girasa de ADN (mantiene el superenrollamiento negativo y se relaja).
Otras proteínas importantes para mantener la estructura nucleoide son las proteínas de unión a ADN no específicas HU y la estructuración de nucleoleo similar a histona (H-NS), y la proteína IHF (factor huésped de integración) que tiene sitios de unión de secuencia de ADN específicos.
La replicación del cromosoma ocurre por los mismos principios universales que guían la replicación en todos los sistemas biológicos.
Es decir, la síntesis de ADN es semiconservativa y siempre ocurre en la dirección 5 ′ a 3 ′.
La síntesis de ADN es semidiscontinua, y la ADN polimerasa necesita una plantilla y un cebador.
En la mayoría de las bacterias, existen tres enzimas de ADN polimerasa, siendo el complejo de holoenzima ADN polimerasa III el responsable de la replicación del cromosoma.
La síntesis de ADN siempre comienza en el mismo sitio denominado origen de replicación y es bidireccional desde ese origen.
Además del complejo de polimerasa, hay una variedad de otras enzimas que contribuyen a la iniciación y síntesis. Algunas de estas enzimas pueden ser objetivos de los antibióticos.
El nucleoide es autoadhesivo
Varias líneas de evidencia revelan que existe una fuerte tendencia a la coalescencia general del material cromosómico, es decir, que el nucleoide es «auto-adherente».
Las imágenes revelan que prácticamente todo el ADN cromosómico forma parte de la forma del nucleoide.
Además, durante el proceso de replicación/segregación, a veces se puede observar que el alargamiento involucra lóbulos del material recién replicado que sobresale, lo que implica una tendencia dinámica intrínseca para la coalescencia en formas alargadas.
Finalmente, la autoadherencia está implícita en el hallazgo de que los loci individuales y los pares de loci tienden a tener posiciones bastante fijas entre sí en los nucleósidos en reposo (G1).
Radial, pero no longitudinal, confinamiento
Las células no septadas exhiben cadenas de nucleósidos discretos en ausencia de límites intercelulares; además, el nucleoide G1 no siempre se extiende hasta el final de la célula.
Por lo tanto, el nucleoide es un objeto discreto en ausencia de «confinamiento longitudinal».
En contraste, el nucleoid toca la periferia interna de la célula en la dimensión radial.
Dado que la forma tiende a ser curvada helicoidalmente, este contacto no es uniforme sino que refleja la trayectoria helicoidal.
Una implicación de esta configuración es que el nucleoide tiende a definir un espacio helicoidal complementario alrededor de la periferia de la célula.
Independientemente de los enlaces moleculares entre el nucleoide y la membrana celular interna, también parece que el nucleoide en su conjunto tiende a «empujar» hacia afuera la periferia de la célula, es decir, que la forma está «confinada radialmente».
El confinamiento del nucleoide en la dimensión radial ocupa un lugar destacado en varios aspectos de la organización, disposición y función de los cromosomas.
En “G1” una forma elipsoidal curva con dualidad longitudinal subyacente
El nucleoide antes de la replicación («G1»), tal como se define en E.coli y C. crescentus, tiende a ser más delgado en los extremos que en el medio, es decir, ser elipsoidal y también deformarse en una hélice con una curva suave.
La curvatura no necesariamente tiene una habilidad específica, lo que implica que la característica importante es la curvatura en sí misma. Además, el ADN nucleoide es más denso centralmente que radialmente.
Detrás de esta forma global está el hecho de que el ADN tiende a organizarse en un par de haces paralelos que se extienden longitudinalmente a lo largo de la longitud del nucleoide y giran suavemente entre sí para dar la forma de nucleoide de forma helicoidal, suavemente curvada.
En C. crescentus, los dos paquetes corresponden a los replichores izquierdo y derecho.
En algunas circunstancias, incluidas las etapas tardías del ciclo celular, el nucleoide aparece como un anillo abierto y/o pares de haces bien separados.
El confinamiento longitudinal podría influir potencialmente en la forma en estas etapas.
Arreglos radiales duales de bucles plectonémicos
El análisis de captura de cromosomas en C. crescentus sugiere que, en ese organismo, la dualidad longitudinal probablemente refleja la existencia de dos objetos paralelos organizados en forma de «cepillo de botella», cada uno de los cuales comprende una serie radial de bucles plectonémicos.
Cada bucle tendría una longitud de ~ 15kb con una superorganización de ~ 100kb. Una organización subyacente similar probablemente explica la dualidad en E.coli.
Si es así, las dos características identificadas podrían conciliar las observaciones anteriores en E.coli que definían de manera diversa un dominio topológicamente superenrollado por ~ 50–100kb versus dominios de ~ 10–15kb).
Diferenciación de dominio
Para la mayoría de las enterobacterias y vibrionáceas, la región terminal está altamente estructurada a través de una proteína dedicada, MatP, una proteína de unión a plectonema con una secuencia de unión preferida cuya ubicación de dominio es específicamente nucleada.
El origen también está incrustado en una región estructurada como se muestra en B.subtils y E.coli. En B. subtili esta estructura es creada por condensina y nucleada por ParB. Los dominios de origen y término también se producen en P.aeruginosa.
Para E.coli, también se ha sugerido la diferenciación del dominio de las regiones intersticiales.
Las definiciones experimentales de estas regiones pueden reflejar tanto el proceso de segregación como las transiciones físicas de diferentes macrosegmentos del genoma.
Dinámica
Las imágenes de lapso de tiempo han definido movimientos dinámicos locales y también han revelado comportamientos dinámicos globales.
Movimiento de loci en escalas de tiempo corto
El movimiento local de un locus cromosómico etiquetado de forma fluorescente se define trazando su desplazamiento cuadrado medio (DCM) frente al tiempo transcurrido de observación.
En un gráfico log-log, el movimiento difusivo simple proporciona una relación lineal con una pendiente de 1.
Para los loci cromosómicos en las bacterias, la relación es lineal pero con una pendiente de menos de 1, lo que implica un movimiento «sub-difusivo».
Este comportamiento se debe a la naturaleza viscoelástica del nucleoide abarrotado: a medida que un locus se mueve, empuja contra las restricciones del entorno, que empujan hacia atrás, impidiendo así el movimiento.
Las explicaciones alternativas, es decir, la adherencia del lugar a las características encontradas o impedimentos de los obstáculos fijos, no son compatibles con los patrones observados.
Un subcomponente importante del coeficiente de difusión aparente es de naturaleza no térmica, con procesos dependientes de ATP que promueven mecánicamente la agitación.
Hasta el momento no se ha identificado una sola proteína motora dominante, con la girasa del ADN, la biosíntesis de la pared celular y el citoesqueleto MreB excluidos como actores principales y la ARN polimerasa que tiene solo un papel secundario.
Un locus monitoreado puede exhibir ocasionalmente movimientos rápidos que exhiben dinámicas «casi balísticas», lo que implica una maquinaria de translocación activa o efectos de estrés-relajación.
Tales movimientos ocurren para los loci en todo el genoma, pero de manera diferente con diferentes coordenadas genómicas.
Estos movimientos no se correlacionan estrictamente con la replicación del ADN, tienden a ocurrir a lo largo de la longitud del nucleoide y, a veces, acompañan las transiciones de segregación de cromosomas.
Dos tipos de dinámica global a nivel de los nucleósidos
Las imágenes de nucleoides completos en E. coli revelan dos comportamientos dinámicos que involucran a todo el nucleoide.
Estos dos comportamientos entran en juego en diferentes escalas de tiempo. En ningún caso se conoce el mecanismo subyacente.
En ambos casos, se propone la eliminación de ataduras entre segmentos (mediadas por proteínas y/o topológicas, a lo largo y entre las hermanas) para desempeñar funciones críticas, haciendo que el nucleoide sea más «fluido».
La fluidez facilitaría los movimientos locales necesarios para diversos procesos cromosómicos, incluido, por ejemplo, el desplazamiento de regiones transcritas para desplazarse a la periferia nuclear para la traducción, así como la dinámica de replicación, segregación hermana y organización.
Ondas de densidad longitudinal
La densidad total de los nucleósidos fluctúa a lo largo de la longitud del nucleoide con una periodicidad de uno a dos minutos, probablemente a lo largo del ciclo celular, con un desplazamiento neto de aproximadamente el 5% del material de los nucleósidos en cada 5 s.
Estas ondas se proponen para promover la movilidad interna del nucleoide al promover la pérdida de ataduras o enredos entre segmentos que de otro modo crearían un gel.
Tal papel sería análogo al que se sospecha para los movimientos de ida y vuelta de los cromosomas de profase meiótica en correlación con la eliminación de enredos no deseados creados durante el emparejamiento de cromosomas.
Extensión y acortamiento de nucleoides cíclicos
La longitud de la célula aumenta monótonamente durante el crecimiento. En contraste, la longitud de los nucleósidos varía de manera discontinua, en un patrón cíclico.
En cada ciclo, un período de cinco minutos de acortamiento de nucleoides es seguido por un período de 20min de alargamiento.
La velocidad de alargamiento aumenta de ~ 10min a un máximo y luego disminuye, y finalmente se vuelve negativa a medida que se produce el acortamiento, seguida por la siguiente fase de elongación.
Estas cinéticas son sorprendentemente consonantes con la acumulación, liberación y disipación de la tensión mecánica viscoelástica, lo que implica la existencia de ciclos de tensión mecánica.
Hasta ahora, estos ciclos están documentados durante un período que incluye, pero se extiende mucho más allá del período de replicación del ADN, con indicios de que también ocurre en G1.
Dichos ciclos podrían comprender un ciclo celular primordial que gobierna el programa de eventos cromosómicos y su vinculación con el ciclo de división celular.
Estos ciclos globales también están implicados específicamente en la segregación hermana.
Se propone que las ataduras aleatorias entre segmentos impidan la formación de una organización de nucleoleo regular (por ejemplo, arrays de bucle radial), lo que tiende a hacer que el nucleoide sea más grande y menos alargado (es decir, más ancho y más corto) en un estado de alta energía (tensión mecánica).
Eventualmente, el nivel de estrés se volverá lo suficientemente alto como para provocar la liberación de las restricciones, permitiendo así el alivio del estrés por el alargamiento.
Este efecto se bloquearía concomitantemente mediante el desarrollo de la organización (bucle radial).
A primera vista, puede parecer contrario a la intuición que la expansión proporcionada por la dinámica de los nucleóidos podría ser biológicamente útil, ya que se acepta comúnmente que la compactación de los cromosomas es un elemento clave en la segregación y organización de los cromosomas.
Sin embargo, se pueden imaginar varios escenarios en los que la descomposición transitoria podría ayudar.
Por ejemplo, uno debe recordar que la condensación global no separará a las hermanas y que específicamente solo la condensación de longitud es capaz de impulsar la segregación.
Una propuesta general es que dicha condensación específica de la hermana (generada, por ejemplo, por supercoiling) se verá afectada o al menos ralentizada por enlaces cruzados moleculares.
Por lo tanto, una expansión de nucleoide local podría disminuir la cantidad de enlaces cruzados, permitiendo posteriormente una condensación longitudinal más eficiente.
De manera más general, existe un acuerdo general de que la organización subyacente del ADN dentro del nucleoide es relativamente regular.
Los eventos moleculares, y en particular la transcripción, perturbarán esa organización, y esas perturbaciones pueden ser restringidas y/o permanentes por enlaces cruzados moleculares.
Las ondas de expansión transitorias podrían volver a suprimir esos enlaces cruzados, permitiendo una reorganización del nucleoid en su estado «ideal».
Función del nucleoide
El nucleoide es esencial para controlar la actividad de la célula y la reproducción. Es donde tienen lugar la transcripción y replicación del ADN.
Dentro de él, podemos esperar encontrar enzimas que sirvan como catalizadores biológicos y ayuden con la replicación, así como otras proteínas que tengan otros roles funcionales y estructurales, como ayudar a la formación de ADN, facilitar el crecimiento celular y regular el material genético del célula.
Conclusión
Siempre se ha previsto que la dinámica de los cromosomas procarióticos y eucarióticos de alguna manera sea fundamentalmente similar.
Las observaciones recientes brindan un fuerte apoyo a esta proposición y aclaran la naturaleza de las relaciones.
Los cromosomas tienden a ser unidades discretas y coherentes en las bacterias como es bien sabido para los eukarotes.
El entorno elástico que gobierna la movilidad de locus a corto plazo y su dependencia de ATP (enzima) es similar en ambos tipos de células.
También lo es la observación de que los loci individuales experimentan movimientos balísticos. Los cromosomas tienen una organización subyacente fundamental que involucra una serie radial de bucles, con pistas de organización de orden superior.
Además, en ambos casos, el «eje» central definido por las bases de bucle y las proteínas asociadas incluye condensina, secuencias ricas en AT y proteínas arquitectónicas que se unen a dichas secuencias.
Las oscilaciones de ida y vuelta de las ondas de densidad longitudinales observadas en E.coli tienen paralelos directos en los núcleos G1 de los mamíferos, así como en la profase meiótica.
Los ciclos globales de contracción/extensión observados en E. coli parecen ser muy paralelos a los ciclos globales de expansión/contracción cromosómica observados en los programas meióticos y mitóticos de los programas de eucariotas, que también están relacionados con la individualización del período de las cromátidas hermanas.
La segregación de hermanas en la anafase en eucariotas está precedida por la individualización morfológica de las hermanas antes e independientemente de las fuerzas del huso, de acuerdo con la evidencia emergente de que los factores internos globales juegan un papel central para la individualización de las hermanas en las bacterias.
