Cloranfenicol: Composición, Manejo y Seguridad, Propiedades Bactericidas, Usos Actuales

mecanismo de acción del cloranfenicol

Es un antibiótico de amplio espectro. Se usa para tratar varias infecciones bacterianas.

En el tratamiento de la conjuntivitis se usa como un ungüento para los ojos.

Composición

Peso molecular: 323.1 g / mol
Fórmula molecular: C11H12Cl2N2O5
Soluciones madre: 10 mg / ml en metanol o hasta 35 mg / ml en etanol y almacenado a -20ºC.
Concentración final: 30-35 μg / mL (para plásmidos con alto contenido de copias)

Manejo y seguridad

El Cloranfenicol se considera peligroso y potencialmente cancerígeno. Use guantes y evite la inhalación de polvo.

Estabilidad

El Cloranfenicol es soluble en agua, pero no tan estable en soluciones acuosas y más susceptible a la hidrólisis por la luz ultravioleta. Tras la degradación, las soluciones de Cloranfenicol se vuelven amarillas y se forma un precipitado amarillo anaranjado.

Modo de acción

Bacteriostático. Inhibe la síntesis de proteínas al interactuar con la porción 50S del ribosoma 70S. A concentraciones más altas puede inhibir la síntesis de ADN.

Modo de resistencia

Resistencia conferida por el producto del gen CAT (Cloranfenicol Acetil Transferasa) de Tn9 (en la resistencia a plásmidos recombinantes se denomina CATR, CAMR o CMR).

Orígenes

El Cloranfenicol es un antibiótico de amplio espectro efectivo contra la mayoría de las cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. El Cloranfenicol se derivó de la bacteria Streptomyces venezuelae y ahora se produce sintéticamente.

En 1950, el Cloranfenicol se convirtió en el primer antibiótico en ser fabricado sintéticamente a gran escala.

El Cloranfenicol es eficaz contra una amplia variedad de microorganismos, pero debido a efectos secundarios graves, incluido el daño a la médula ósea, que provoca anemia aplásica en humanos.

El Cloranfenicol ahora solo se usa en humanos para el tratamiento de infecciones graves y potencialmente mortales (p. , fiebre tifoidea).

Propiedades Bactericidas

  • El Cloranfenicol es bacteriostático pero puede ser bactericida a altas concentraciones.
  • Detiene el crecimiento bacteriano uniéndose al ribosoma bacteriano (bloqueando la Peptidil transferasa) e inhibiendo la síntesis de proteínas.
  • Se usa como marcador seleccionable en experimentos de clonación molecular en los que un gen de Cloranfenicol acetil transferasa funcional (CAT) conferirá resistencia a las células que contienen el plásmido. E. coli se cultiva en medios con Cloranfenicol y solo las células transformadas con plásmidos que contienen el gen CAT (en plásmidos conocidos como CATR, CAMR o CMR) sobrevivirán.
  • El Cloranfenicol es soluble en lípidos, lo que le permite difundir a través de la membrana celular bacteriana. Luego se une reversiblemente a la proteína L16 de la subunidad 50S de los ribosomas bacterianos, donde la transferencia de aminoácidos a cadenas Peptídicas en crecimiento se previene disminuyendo la constante de velocidad catalítica de Peptidil Transferasa.

La supresión de la actividad Peptidil Transferasa inhibe la formación del enlace Peptídico y la posterior síntesis de proteínas.

La resistencia natural al Cloranfenicol en las bacterias se debe a la actividad de la enzima Cloranfenicol Acetil Transferasa codificada por el gen CAT.

La Cloranfenicol Acetil Transferasa cataliza la transferencia de un grupo acetilo desde la Acetil Coenzima A (Acetil COA) al grupo hidroxilo C3 del antibiótico.

El producto de la reacción, Acetilo Cloranfenicol, no se une al centro Peptidil Transferasa de los Ribosomas 70S ni inhibe la Peptidil Transferasa.

Existen tres mecanismos de resistencia al Cloranfenicol:

  1. La permeabilidad reducida de la membrana.
  2. La mutación de la subunidad ribosómica 50S.
  3. La expresión del gen de Cloranfenicol Acetil Transferasa (CAT).

Las mutaciones que confieren resistencia de la subunidad ribosómica 50S son raras. Es fácil seleccionar para reducir la permeabilidad de la membrana al Cloranfenicol in vitro por el paso en serie de bacterias, y este es el mecanismo más común de resistencia de bajo nivel de Cloranfenicol.

Las cepas de Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram negativas expresan de manera constitutiva la Cloranfenicol Acetil Transferasa transportada en los plásmidos, lo que confiere resistencia a los fármacos (por lo que son naturalmente resistentes al Cloranfenicol).

Se han descrito varias variantes del gen CAT, todas las cuales forman trímeros de subunidades idénticas.

La variante de tipo I codificada por un segmento de 1102 pb del Transposón Tn9 se usa ampliamente como un gen informador en el que un promotor mínimo se fusiona con la secuencia variante de tipo I, para medir la expresión de CAT transitoria.

La mayoría de los análisis cinéticos y estructurales se han llevado a cabo con la variante tipo III del gen CAT, que produce cristales adecuados para el análisis de rayos X.

Avances en la investigación Bacteriana

En la década de 1970 y principios de los 80 en laboratorios de biología molecular, el Cloranfenicol a menudo se agregaba a cultivos en crecimiento de plásmidos de copia moderada y alta.

El Cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas y bloquea la síntesis de ADN del huésped, pero no tiene ningún efecto sobre la replicación de plásmidos relajados (copia alta). El número de copias de plásmidos relajados aumenta durante la incubación del cultivo bacteriano en el fármaco.

La amplificación es necesaria para lograr altos rendimientos de plásmidos relajados, que normalmente se replican solo en cantidades moderadas en sus bacterias hospedadoras.

En presencia de Cloranfenicol, estos vectores que contienen replicón de pMB1 o colE1 de tipo salvaje, continúan hasta 2000 o 3000 copias se han acumulado en la célula. Plásmidos después de 1982 (p. Ej., PUC plásmidos) contienen un replicón de colE1 modificado y se replican en números de copia tan altos que la amplificación es innecesaria.

Usos Actuales

Hoy en día, el tratamiento de cultivos bacterianos con Cloranfenicol aún puede tener algunas ventajas. Dado que el Cloranfenicol bloquea la replicación bacteriana, el número de copias de los plásmidos aumenta dos o tres veces más en presencia del fármaco a medida que se reduce el volumen y la viscosidad del lisado bacteriano, lo que simplifica la purificación de los plásmidos.

Muchos investigadores encuentran que agregar Cloranfenicol a una cultura en crecimiento es mucho más conveniente que lidiar con un lisado altamente viscoso. Los plásmidos que usan la proteína RepA como un regulador positivo (p. Ej., PSC101) no pueden amplificarse con Cloranfenicol.

Durante muchos años, se pensó que la amplificación de plásmidos en presencia de Cloranfenicol fue efectiva solo cuando la bacteria huésped se cultivó en medios mínimos.

Sin embargo, un protocolo que utiliza medio rico con Cloranfenicol proporciona rendimientos reproduciblemente altos con cepas de E. coli que albergan plásmidos de bajo número de copias que portan el replicón pMB1 o colE1.

Los rendimientos mejorados de pBR322 y sus derivados se han obtenido a partir de cultivos tratados con bajas concentraciones de Cloranfenicol (10-20 μg / ml) que no suprimen completamente la síntesis de la proteína del huésped.

Las razones de estos resultados no se comprenden, pero podría explicarse si la replicación de plásmidos que portan el origen colE1 requiere un factor de hospedador inestable que continúe sintetizándose durante la inhibición parcial de la síntesis de proteínas.

El sitio activo de la Cloranfenicol Acetil Transferasa contiene un residuo de Histidina y se postula que actúa como un catalizador de base general en la reacción de acetilación.

Los dos sustratos de Cloranfenicol y Acetil-CoA se acercan al sitio activo a través de túneles ubicados en lados opuestos de la molécula.

Debido a que la enzima CAT tiene un contenido relativamente alto de residuos de Histidina, esto da como resultado una co-purificación con proteínas marcadas con His en columnas NTA de Ni si la proteína marcada con His se expresó en cepas de E. coli resistentes al Cloranfenicol.

No se recomienda usar tales cepas bacterianas para la expresión de proteínas etiquetadas con His recombinantes.