Son endopeptidasas que digieren el colágeno nativo en la región de triple hélice.
Los colágenos son el principal componente fibroso del tejido conectivo extracelular animal. Las colagenasas bacterianas difieren de las colagenasas de vertebrados en que exhiben una especificidad de sustrato más amplia.
A diferencia de las colagenasas animales que separan el colágeno en su conformación nativa de triple hélice. La colagenasa bacteriana es única porque puede degradar tanto los colágenos nativos insolubles en agua como los desnaturalizados solubles en agua.
Puede atacar a casi todos los tipos de colágeno y es capaz de hacer múltiples hendiduras dentro de regiones de triple hélice.
Historia
Mucho de lo que se conoce actualmente sobre las características de la colagenasa clostridial proviene de los estudios pioneros en la década de 1950 por Mandl, Seifter, Harper y sus asociados, y el trabajo de clasificación posterior de Van Wart y Bond.
En 1959, Worthington ofreció la primera colagenasa comercialmente disponible aislada de Clostridium histolyticum. En ese momento, solo se ofrecía una preparación de enzima cruda.
Después de las colagenasas de Clostridium histolyticum fueron preparadas por primera vez por Mandl et al., los estudios de finales de la década de 1950 a mediados de la década de 1980 encontraron que existen varias colagenasas separables y las características y estabilidades de estas fracciones se caracterizaron parcialmente.
Se encontró que los pesos moleculares de estas siete colagenasas variaban entre 68 kDa y 130 kDa, y se clasificaron como Clase I o Clase II, sobre la base de una variedad de propiedades.
Se encontró que estas clases difieren con respecto a sus actividades, estabilidades y composición de aminoácidos, pero comparten muchas similitudes.
Hasta 1962, la mayor parte del interés en las colagenasas se centraba en las colagenasas clostridiales. En ese año, Gross y Lapiere obtuvieron pruebas de una colagenasa en los medios de cultivo tisular de renacuajo rana, que fue el descubrimiento de la primera colagenasa de vertebrados.
Después de este descubrimiento, se encontró una gran cantidad de colagenasas en la vida marina, otras bacterias, anfibios y mamíferos.
Se informaron otros estudios de colagenasas de humanos y otras fuentes de mamíferos, y se continúan estudiando activamente para comprender mejor la patología y el tratamiento de las enfermedades humanas.
De particular interés es la relación entre la colagenasa y la artritis reumatoide, metástasis, desbridamiento de heridas, tratamiento de disco herniado, angiogénesis, reparación de tejidos y cirrosis.
Especificidad
Los sitios hiperreactivos donde las enzimas de Clase I y Clase II inicialmente atacan a los tres tipos de colágeno fueron identificados por French et al. Los sitios de corte están todos en los enlaces Yaa-Gly en la secuencia repetitiva de colágeno Gly-X.
La capacidad de las colagenasas clostridiales para digerir colágenos nativos de triple hélice I, II y III en una mezcla de pequeños péptidos es su principal factor distintivo. Esto se logra haciendo múltiples escisiones en la triple hélice. La digestión se completa hidrolizando esos fragmentos en una mezcla de pequeños péptidos.
Por el contrario, las colagenasas de vertebrados inician la colagenolisis al hacer una única escisión en las tres cadenas alfa, después de lo cual el ataque sobre esas cadenas alfa es muy limitado. Las gelatinasas y otras proteasas luego llevan a cabo la colagenolisis solo después de la desnaturalización de la triple hélice.
Características moleculares
La colagenasa es producida por dos genes separados y distintos en Clostridium histolyticum. Ambos genes han sido clonados y secuenciado. El gen col G codifica para la colagenasa tipo I, un péptido de 936 aminoácidos.
El gen col H codifica para la colagenasa tipo II, un péptido de 1021 aminoácidos. Estos genes comparten el 72% de identidad, y las proteínas comparten el 43% de identidad.
Ambos productos génicos pueden estar presentes como dos o más isoformas que difieren en peso molecular. Por lo tanto, las mezclas crudas de colagenasa pueden contener de seis a ocho especies de diferentes pesos moleculares que varían de 68 a 130 kDa.
Estudios de especificidad de sustrato han demostrado que el gen col G prefiere sustratos naturales como el colágeno intacto, en comparación con la colProducto del gen H Por el contrario, el producto del gen col H actúa preferentemente sobre sustratos sintéticos cortos (FALGPA) en relación con el producto del gen col G.
Composición
Las colagenasas de Clostridium representan metaloproteasas inusualmente grandes, una familia de proteasas que comparte un motivo que contiene zinc en el centro del sitio activo.
Números de acceso a proteínas:
- Q9X721 (ColG, Teórico).
- Q46085 (ColH, Teórico).
Clasificación CATH (v. 3.2.0):
- Clase: Principalmente beta.
- Topología: Rollos de gelatina.
Peso molecular: 68-130 kDa.
PH óptimo: 6.3-8.5.
Punto isoeléctrico
- 5.63 (ColG, teórico).
- 5.58 (ColH, Teórico).
Coeficiente de extinción:
- 159,970 cm -1 M -1 (ColG, teórico).
- 150,130 cm -1 M -1 (ColH, teórico).
- E 1%, 280 = 13.20 (ColG, Teórico).
- E 1%, 280 = 13.40 (ColH, Teórico).
Activadores:
- Ca 2+.
- Zn 2+.
Inhibidores:
- EDTA, EGTA.
- Cisteína, histidina.
- TDT.
- 2-mercaptoetanol.
- o –fenantrolina.
- Hg 2+ , Pb 2+ , Cd 2+ , Cu 2+.
- No inhibido por DFP o suero.
La colagenasa también es inhibida por la α2 – macroglobulina, una gran glucoproteína plasmática Nagase et al. y Stricklin y Welgus informan sobre los inhibidores naturales de la colagenasa.
La enzima de la piel humana es inhibida por el suero humano, pero la colagenasa de granulocitos no. El suero humano contiene alpha 2 macroglobulina y alfa 1 -antitripsina que puede inhibir ciertas colagenasas, así como un tercer inhibidor reportado por Woolley et al.
También se ha demostrado que la colagenasa A se fotoactiva en presencia de azul de metileno.
Aplicaciones
- Aislamiento de adipocitos, hepatocitos y células de pulmón, epitelio y tejido suprarrenal.
- Aislamiento de cardiomiocitos y células de hueso, cartílago, músculo, tiroides y endotelio.
- Aislamiento de mamas y varios otros tejidos blandos.
- Aislamiento de células de islotes pancreáticos humanos y porcinos.
- El tratamiento de tejidos con colagenasa bruta, con su mezcla de actividades proteolíticas, proporciona una digestión suave y selectiva de la matriz intercelular con poco daño a las células o pérdida de viabilidad.
- La colagenasa AFA es adecuada para aplicaciones que necesitan evitar la introducción de patógenos derivados de animales en procedimientos de bioprocesamiento.
