La mayoría de las células epiteliales de los animales tienen una capa similar a una pelusa en la superficie externa de sus membranas plasmáticas.
El glicocalix, también conocido como la matriz pericelular, es una cubierta de glucoproteína y glucolípidos que rodea las membranas celulares de algunas bacterias, epitelios y otras células.
Este revestimiento consiste en varios restos de hidratos de carbono de glucolípidos de membrana y glicoproteínas, que sirven como moléculas de la columna vertebral para el soporte.
En general, la porción de carbohidratos de los glicolípidos que se encuentran en la superficie de las membranas plasmáticas ayuda a estas moléculas a contribuir al reconocimiento, la comunicación y la adhesión intercelular de las células celulares.
El glicocalix es un tipo de identificador que el cuerpo usa para distinguir entre sus propias células sanas y los tejidos trasplantados, las células enfermas o los organismos invasores.
En el glicocalix están incluidas las moléculas de adhesión celular que permiten que las células se adhieran unas a otras y guíen el movimiento de las células durante el desarrollo embrionario.
El glicocalix desempeña un papel principal en la regulación del tejido vascular endotelial, incluida la modulación del volumen de glóbulos rojos en los capilares.
El limo en el exterior de un pez es un ejemplo de glicocalix. El término se aplicó inicialmente a la matriz polisacárida que recubre las células epiteliales, pero se ha descubierto que sus funciones van mucho más allá.
Historia
El glucocálix endotelial ya fue visualizado hace unos 40 años por Luft utilizando microscopía electrónica. Aún así, se conoce relativamente poco de la composición y función de esta capa.
En las últimas décadas, ha sido cada vez más apreciado como un factor importante en la fisiología y la patología vascular, como se describe en 2000 en una revisión de Pries et al. y en otras revisiones más recientes.
El interés en el papel fisiológico (patho) del glicocalix comenzó con la observación del hematocrito de tubo capilar bajo y variable, que dependía del nivel de activación metabólica y farmacológica del sistema vascular.
La relación entre el metabolismo y los aumentos inducidos por los agonistas en la velocidad de los glóbulos rojos, por un lado, y el hematocrito en el otro, podría explicarse en parte por el desnatado con plasma como continuación directa del efecto Fåhraeus.
Sin embargo, esta relación se disocia del tratamiento local de los microvasos con heparinasa, una enzima que descompone los sulfatos de heparano en el glicocalix.
Este hallazgo estuvo de acuerdo con las estimaciones teóricas que predicen una capa de plasma de movimiento lento de 1,2 μm sobre el endotelio.
Los estudios in vivo han revelado que el glucocálix en los capilares musculares es una capa de aproximadamente 0,5 μm de grosor, que cubre las células endoteliales y determina los dominios luminales para macromoléculas, glóbulos rojos y blancos.
Estudios más recientes indican que el grosor del glicocalixo aumenta con el diámetro vascular, al menos en el sistema arterial, que varía de 2 a 3 μm en arterias pequeñas a 4,5 μm en arterias carótidas.
Hasta la fecha, muchos estudios indican una variedad de funciones (pató) fisiológicas para el glicocalix endotelial; además de modular el llenado capilar de glóbulos rojos, el glicocalix puede afectar muchas otras funciones (dis) del sistema vascular.
Mientras que actualmente se cree que el endotelio vascular está activamente involucrado «en cada patología que presenta proyecciones vasculares», el mismo dicho bien podría ser cierto para el glicocalix.
La evaluación de esta posible implicación del glicocalix endotelial requiere una visualización confiable de esta delicada capa, lo cual es un gran desafío.
Composición
El glicocalix endotelial es una capa rica en carbohidratos que recubre el endotelio vascular. Se considera que está conectado al endotelio a través de varias moléculas «principales», principalmente proteoglicanos y también glicoproteínas.
Estos forman una red en la que se incorporan moléculas solubles derivadas del plasma o del endotelio.
Más luminalmente, el glicocalixo está formado por componentes solubles del plasma, unidos entre sí de forma directa o mediante proteoglicanos solubles y/o glicosaminoglicanos.
Existe un equilibrio dinámico entre esta capa de componentes solubles y la sangre que fluye, afectando continuamente la composición y el grosor del glicocalix.
Además, el glicocalix sufre de desprendimiento enzimático o inducido por cizalla. El equilibrio dinámico entre la biosíntesis y el desprendimiento hace que sea difícil definir el glicocalix geométricamente.
La composición de la malla de proteoglicanos, glicoproteínas y glicosaminoglicanos unidos a la membrana y la composición de proteínas plasmáticas asociadas y glicosaminoglicanos solubles no se pueden ver como una imagen estática.
En cambio, la capa en su conjunto, también conocida como capa superficial endotelial (ESL, por sus siglas en inglés), es muy dinámica, con moléculas unidas a la membrana que se reemplazan constantemente y sin un límite definido entre los elementos localmente sintetizados y asociados.
El hialuronano unido a la membrana puede alcanzar longitudes de> 1 μm.
Las técnicas de visualización directa no demuestran claras diferencias de composición dentro del glicocalix, desde la membrana endotelial hacia la luz vascular, sino que indican que el glicocalix endotelial se asemeja a una intrincada red autoensamblada 3D de varios polisacáridos.
La eliminación enzimática de cualquiera de sus componentes afecta dramáticamente las propiedades de glicocalix, lo que ejemplifica la importancia de considerar la interacción sinérgica de todos los constituyentes de glicocalix como un todo.
Ubicación
En el tejido endotelial vascular
El glicocalix se encuentra en la superficie apical de las células endoteliales vasculares que revisten el lumen.
Cuando los vasos se tiñen con tintes catiónicos, como el azul de Alcian, la microscopía electrónica de transmisión muestra una capa pequeña de forma irregular que se extiende aproximadamente a 50-100 nm en la luz de un vaso sanguíneo.
Otro estudio usó microscopía electrónica de criotransmisión y mostró que el glucocálix endotelial podría tener un grosor de hasta 11 μm. Está presente en una amplia gama de lechos microvasculares (capilares) y macrovasos (arterias y venas).
El glucocálix también consiste en una amplia gama de enzimas y proteínas que regulan la adherencia de leucocitos y trombocitos, ya que su papel principal en la vasculatura es mantener la homeostasis del plasma y de la pared del vaso. Estas enzimas y proteínas incluyen:
- Síntesis de óxido nítrico endotelial (SON endotelial).
- Superóxido dismutasa extracelular (SDE3).
- Enzima convertidora de angiotensina.
- Antitrombina III.
- Lipoproteína lipasa.
- Apolipoproteínas.
- Factores de crecimiento.
- Quimiocinas.
Las enzimas y proteínas enumeradas anteriormente sirven para reforzar la barrera de glicocalix contra enfermedades vasculares y de otro tipo.
Otra función principal del glicocalix dentro del endotelio vascular es que protege las paredes vasculares de la exposición directa al flujo sanguíneo, mientras que sirve como una barrera de permeabilidad vascular.
Sus funciones de protección son universales en todo el sistema vascular, pero su importancia relativa varía según su ubicación exacta en la vasculatura.
En el tejido microvascular, el glicocalix sirve como una barrera de permeabilidad vascular al inhibir la coagulación y la adhesión de leucocitos.
Los leucocitos no deben adherirse a la pared vascular porque son componentes importantes del sistema inmunitario que deben poder viajar a una región específica del cuerpo cuando sea necesario.
En el tejido vascular arterial, el glucocáliz también inhibe la coagulación y la adhesión de los leucocitos, pero a través de la mediación de la liberación de óxido nítrico inducida por estrés cortante.
Otra función protectora en todo el sistema cardiovascular es su capacidad de afectar la filtración del líquido intersticial desde los capilares hacia el espacio intersticial.
El glicocalix, que se encuentra en la superficie apical de las células endoteliales, está compuesto por una red cargada negativamente de proteoglicanos, glucoproteínas y glicolípidos.
En bacterias y naturaleza
Un glicocalix, que literalmente significa «capa de azúcar», es una red de polisacáridos que se proyectan desde las superficies celulares de las bacterias, que lo clasifica como un componente superficial universal de una célula bacteriana, que se encuentra justo fuera de la bacteria pared celular.
Un glicocalix gelatinoso distinto se llama cápsula, mientras que una capa irregular y difusa se llama capa de limo. Este pelaje está extremadamente hidratado y se tiñe con rojo rutenio.
Las bacterias que crecen en ecosistemas naturales, como en el suelo, los intestinos bovinos o el tracto urinario humano, están rodeadas por una especie de microcolonia encerrada en glicocalix.
Sirve para proteger a la bacteria de los fagocitos dañinos al crear cápsulas o permitir que la bacteria se adhiera a superficies inertes, como dientes o rocas, a través de biopelículas.
Como por ejemplo, Streptococcus pneumoniae se adhiere a células de pulmón, procariotas u otras bacterias que pueden fusionarse sus glycocalices para envolver a la colonia.
En el tracto digestivo
También se puede encontrar un glicocalix en la parte apical de las microvellosidades dentro del tracto digestivo, especialmente dentro del intestino delgado.
Crea una red de 0.3 μm de espesor y consiste en mucopolisacáridos ácidos y glicoproteínas que se proyectan desde la membrana plasmática apical de las células epiteliales absorbentes.
Proporciona una superficie adicional para la adsorción e incluye enzimas secretadas por las células de absorción que son esenciales para los pasos finales de la digestión de proteínas y azúcares.
Otras funciones generalizadas
Protección: amortigua la membrana plasmática y la protege de daños químicos.
Inmunidad a la infección: permite al sistema inmunitario reconocer y atacar selectivamente organismos extraños.
Defensa contra el cáncer: los cambios en el glicocalix de las células cancerosas permiten que el sistema inmunitario los reconozca y los destruya.
Compatibilidad con trasplantes: forma la base para la compatibilidad de transfusiones de sangre, injertos de tejidos y trasplantes de órganos.
Adherencia celular: une las células para que los tejidos no se deshagan.
Regulación de la inflamación: el recubrimiento de Glicocalix en las paredes endoteliales de los vasos sanguíneos evita que los leucocitos rueden o se unan en estados saludables.
Fertilización: permite que los espermatozoides reconozcan y se unan a los huevos.
Desarrollo embrionario: dirige las células embrionarias a sus destinos en el cuerpo.
Técnicas de visualización
Debido a la importancia funcional del glicocalix endotelial, el desarrollo de técnicas de visualización directa es crucial para establecer su función exacta.
El glicocalix puede etiquetarse mediante la administración de marcadores específicos que se unen a uno o más de sus componentes, lo que los hace fluorescentes o detectables.
La preparación de (partes de) el vaso permitiría entonces obtener imágenes microscópicas específicas del glicocalix endotelial.
Lamentablemente, el glicocalix es muy vulnerable y se altera o deshidrata con facilidad durante los protocolos de manipulación y preparación de los vasos.
Como resultado, las dimensiones del glicocalix se subestiman fácilmente, lo cual se ilustra con las primeras imágenes del glicocalix, hechas por microscopía electrónica de transmisión (MET) en 1966 con el uso de la sonda rutenio rojo.
El grosor del glucocáliz medido de esta manera se aproximó a 20 nm en los capilares. Desde entonces, se hicieron muchos otros intentos para obtener imágenes del glicocalix usando microscopía electrónica de transmisión.
En células endoteliales de aorta bovina bajo condiciones de esfuerzo de cizallamiento de 3.0 Pa, se informo que el glucocáliz tenia un espesor de 40 nm.
Estas dimensiones no cumplieron con las estimaciones teóricas que predicen que el glicocalix tiene un grosor de hasta 1 μm.
Usando un nuevo protocolo de tinción con Alcian blue 8GX, van den Berg et al. recientemente se aplicó microscopía electrónica de transmisión para medir las dimensiones del glicocalix endotelial en capilares de miocardio de rata.
Este estudio reveló que las células endoteliales están cubiertas por un glucocálix de 200 a 500 nm de grosor.
El tratamiento con hialuronidasa antes de la fijación y la tinción dio como resultado una reducción significativa de esta capa a 100-200 nm.
Los grupos de Haraldsson y de Rostgaard y Qvortrup mejoraron el protocolo de tinción de microscopía electrónica de transmisión usando fijadores de oxígeno basados en fluorocarbonos, revelando glicocalyces tan gruesos como 60-200 nm en capilares glomerulares y 50-100 nm en capilares fenestrados intestinales.
Aparentemente, los nuevos protocolos de tinción y preparación mejoraron la conservación del glicocalix en experimentos de microscopía electrónica de transmisión. Sin embargo, la microscopía electrónica de transmisión no puede usarse en la situación in vivo.
Aproximadamente 30 años después de que se realizaran las primeras imágenes de microscopía electrónica de transmisión, Vink et al. utilizaron microscopía intravital para visualizar el glicocalix endotelial en los capilares del músculo cremáster de hámster in vivo usando abordajes indirectos.
El glicocalix fue reconocido como una «zona de exclusión» o «espacio» entre los glóbulos rojos que fluyen y el endotelio. Además, el plasma se marcó con un dextrano fluorescente, y el glicocalix apareció entonces como una zona de exclusión del plasma.
Curiosamente, no se encontró una zona de exclusión para los glóbulos blancos, lo que sugiere que tienen la capacidad de comprimir el glicocalix en estos vasos, lo que cumple con la baja rigidez estimada del glicocalix.
La resta del diámetro de la columna de plasma del diámetro interno anatómico reveló las dimensiones del glicocalix, que parecía tener un grosor de 0.4-0.5 μm.
Este método ha sido utilizado en muchos estudios desde entonces, principalmente en la microcirculación del músculo cremáster de hámsters o ratones.
Este tejido es adecuado para la microscopía intravital porque es delgado y translúcido, lo que permite una visualización clara de las células endoteliales microvasculares y de los glóbulos sanguíneos, con un movimiento de la pared del vaso bajo o ausente.
Además, se pueden medir las velocidades de flujo locales. Sin embargo, la estimación del grosor del glicocalix usando métodos basados en microscopía intravital es indirecta. Además, la microscopía intravital no se puede aplicar para obtener imágenes del glicocalix endotelial en vasos más grandes.
La visualización directa del glicocalix se ha realizado a través de varios enfoques, la mayoría usando lectinas que son proteínas que se unen a restos disacáridos específicos de cadenas de glicosaminoglicanos.
Otras etiquetas incluyen anticuerpos para sulfato de heparano, sindecano-1 o hialuronano. Al unir estos marcadores a una sonda fluorescente, se pueden aplicar técnicas microscópicas avanzadas para visualizar el glicocalix.
La microscopía de escaneo láser confocal (CLSM, por sus siglas en inglés) permite el seccionamiento óptico con una buena resolución óptica, lo que permite la reconstrucción en 3D de la muestra.
El marcaje con lectina del glicocalix de células endoteliales de vena umbilical humana cultivadas y la posterior obtención de imágenes de microscopía de barrido con láser confocal revelaron una capa superficial tan gruesa como 2,5 ± 0,5 μm.
La microscopía de barrido con láser confocal también se ha usado para detectar cambios de concentración de lectinas marcadas fluorescentemente en el glicocalix de las vénulas poscapilares del mesenterio de rata fijas en caso de isquemia/reperfusión e inflamación.
Debido a que los vasos más grandes tienen paredes más gruesas, lo que resulta en profundidades menores de penetración de luz con pérdida significativa de resolución a profundidades mayores (> 40 μm).
Debido a una mayor dispersión de señal, la microscopía confocal de escaneo láser es menos adecuada para obtener imágenes del glicocalix en las arterias.
Una técnica prometedora para visualizar directamente el glicocalix en vasos más grandes, tanto ex vivo como in vivo, es la microscopía de barrido con láser de dos fotones (TPLSM, por sus siglas en inglés).
La microscopía de escaneo láser de dos fotones depende de la excitación de un fluoróforo por captación simultánea (es decir, dentro de 10-18 s) de dos fotones rojos, en lugar de un fotón azul como en la excitación de fluorescencia convencional.
El uso de fotones rojos de longitud de onda larga reduce la dispersión y, por lo tanto, aumenta la profundidad de penetración en el tejido.
La excitación del fluoróforo y la consiguiente fluorescencia solo se produce en el punto focal del cono de iluminación, ya que la probabilidad de excitación de dos fotones depende de la intensidad al cuadrado de los fotones excitadores.
Cualquier luz recibida por los fotomultiplicadores tiene que originarse desde la posición focal, por lo que la dispersión de los fotones emitidos no influye en la resolución y no se requieren picaduras.
Como consecuencia, el microscopio de barrido láser de dos fotones ofrece una buena resolución y sección óptica a una velocidad de adquisición razonable, mientras que el blanqueo y la fototoxicidad de los tintes se limitan a la posición focal.
La combinación de profundidad de penetración mejorada, buena resolución, corte óptico y baja fototoxicidad hace que la microscopía de escaneo láser de dos fotones sea una técnica adecuada para visualizar el delicado glicocalix endotelial en vasos más grandes.
Esta idea fue confirmada por un estudio reciente de Megens y sus colegas en el que se obtuvo una imagen del glicocalix endotelial con microscopía de barrido con láser de dos fotones en arterias carótidas de ratón intactas; el grosor del glicocalixo fue de 4.5 ± 1.0 μm.
Como el microscopio de barrido con láser de dos fotones también se aplica in vivo en roedores, podría ser un buen enfoque para la visualización in vivo del glicocalix en la macrocirculación de estos animales.
Conclusiones
Sobre el endotelio vascular, el glicocalix es una malla unida a la membrana en la que se integran las moléculas derivadas del plasma.
Ejerce una variedad de funciones, importantes en la fisiología vascular normal y también en la enfermedad vascular.
Aunque los datos de experimentos en microcirculación y, más recientemente, en la macrocirculación sugieren fuertemente un papel vasculoprotector para el glicocalix, la investigación sobre este tema se ve obstaculizada por la falta de una buena técnica de visualización.
La microscopía láser de dos fotones puede ser una herramienta exitosa para lograr la visualización directa del glicocalix en arterias más grandes en roedores, tanto ex vivo como in vivo, con la posibilidad de analizar variaciones focales en la composición o integridad de esta capa.
