Es una pequeña molécula de ADN dentro de una célula que está físicamente separada de un ADN cromosómico y puede replicarse independientemente.
Se encuentran comúnmente como pequeñas moléculas circulares de ADN de doble cadena en bacterias; sin embargo, los plásmidos a veces están presentes en arqueas y organismos eucarióticos.
En la naturaleza, los plásmidos a menudo portan genes que pueden beneficiar la supervivencia del organismo, por ejemplo, la resistencia a los antibióticos.
Si bien los cromosomas son grandes y contienen toda la información genética esencial para vivir en condiciones normales, los plásmidos suelen ser muy pequeños y contienen solo genes adicionales que pueden ser útiles para el organismo en determinadas situaciones o condiciones particulares.
Los plásmidos artificiales son ampliamente utilizados como vectores en la clonación molecular, lo que sirve para impulsar la replicación de las secuencias de ADN recombinante dentro de los organismos hospedadores.
En el laboratorio, los plásmidos se pueden introducir en una célula mediante transformación.
Los plásmidos se consideran replicones, unidades de ADN capaces de replicarse de forma autónoma dentro de un huésped adecuado. Sin embargo, los plásmidos, como los virus, generalmente no se clasifican.
Los plásmidos se transmiten de una bacteria a otra (incluso de otra especie) principalmente a través de la conjugación.
Esta transferencia de material genético de huésped a huésped es un mecanismo de transferencia horizontal de genes, y los plásmidos se consideran parte del moviloma.
A diferencia de los virus (que recubren su material genético en una capa de proteína protectora llamada cápside), los plásmidos son ADN «desnudo» y no codifican los genes necesarios para encapsular el material genético y transferirlo a un nuevo huésped.
Sin embargo, algunas clases de plásmidos codifican el pilus conjugativo «sexual» necesario para su propia transferencia. El tamaño del plásmido varía de 1 a más de 200 kbp, y el número de plásmidos idénticos en una sola célula puede variar de uno a miles en algunas circunstancias.
La relación entre los microbios y el ADN del plásmido no es parasitaria ni mutualista, ya que cada uno implica la presencia de una especie independiente que vive en un estado perjudicial o comensal con el organismo huésped.
Por el contrario, los plásmidos proporcionan un mecanismo para la transferencia horizontal de genes dentro de una población de microbios y típicamente proporcionan una ventaja selectiva en un estado ambiental dado.
Los plásmidos pueden transportar genes que proporcionan resistencia a antibióticos naturales en un nicho ecológico competitivo.
O las proteínas producidas pueden actuar como toxinas en circunstancias similares, o permiten al organismo utilizar compuestos orgánicos particulares que serían ventajosos cuando los nutrientes son escasos.
Historia
El término plásmido se introdujo en 1952 por el biólogo molecular estadounidense Joshua Lederberg para referirse a «cualquier determinante hereditario extracromosómico».
El término incluye cualquier material genético bacteriano que existe extracromosómicamente durante al menos parte de su ciclo de replicación.
Sino porque esa descripción incluye virus bacterianos, la noción de plásmido se refinó con el tiempo para comprender elementos genéticos que se reproducen de manera autónoma.
Más tarde, en 1968, se decidió que el plásmido plazo debe ser adoptado como el término para elemento genético extracromosómico, y para distinguirlo de los virus, la definición se redujo a elementos genéticos que existen exclusivamente o predominantemente fuera del cromosoma y puede replicar de manera autónoma.
Propiedades y características
Para que los plásmidos se repliquen independientemente dentro de una célula, deben poseer un tramo de ADN que pueda actuar como un origen de replicación. La unidad autorreplicante, en este caso el plásmido, se llama replicón.
Un replicón bacteriano típico puede consistir en una serie de elementos, como el gen para la proteína de iniciación de replicación específica del plásmido (Rep), unidades repetitivas llamadas iterones, cajas DnaA y una región rica en AT adyacente.
Los plásmidos más pequeños hacen uso de las enzimas replicativas del huésped para hacer copias de sí mismos, mientras que los plásmidos más grandes pueden transportar genes específicos para la replicación de esos plásmidos.
Algunos tipos de plásmidos también pueden insertarse en el cromosoma del huésped, y estos plásmidos integradores a veces se denominan episomas en procariotas.
Los plásmidos casi siempre llevan al menos un gen. Muchos de los genes transportados por un plásmido son beneficiosos para las células hospedadoras, por ejemplo:
Permiten que la célula huésped sobreviva en un entorno que de otro modo sería letal o restrictivo para el crecimiento.
Algunos de estos genes codifican rasgos de resistencia a antibióticos o resistencia a metales pesados.
Mientras que otros pueden producir factores de virulencia que permiten a una bacteria colonizar un huésped y superar sus defensas.
O tienen funciones metabólicas específicas que le permiten a la bacteria utilizar un nutriente particular, incluyendo la capacidad de degradar compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos.
Los plásmidos también pueden proporcionar a las bacterias la capacidad de fijar nitrógeno.
Sin embargo, algunos plásmidos no tienen un efecto observable sobre el fenotipo de la célula huésped o no se puede determinar su beneficio para las células hospedadoras, y estos plásmidos se denominan plásmidos crípticos.
Los plásmidos que se producen naturalmente varían mucho en sus propiedades físicas. Su tamaño puede variar desde mini-plásmidos muy pequeños de menos de 1 kilobase de pares (Kbp) hasta megaplasmids muy grandes de varios pares de megabases (Mbp).
En el extremo superior, poco puede diferenciar entre un megaplasmido y un minicromosoma.
Los plásmidos son generalmente circulares; sin embargo, también se conocen ejemplos de plásmidos lineales. Estos plásmidos lineales requieren mecanismos especializados para replicar sus extremos.
Los plásmidos pueden estar presentes en una celda individual en un número variable, que varía de uno a varios cientos.
El número normal de copias de plásmido que se pueden encontrar en una sola célula se denomina número de copias y está determinado por la forma en que se regula la iniciación de la replicación y el tamaño de la molécula.
Los plásmidos más grandes tienden a tener números de copias más bajos.
Dichos plásmidos de copia única tienen sistemas que intentan distribuir activamente una copia a ambas células hijas. Estos sistemas, que incluyen el sistema parABS y el sistema parMRC, a menudo se denominan sistema de partición o función de partición de un plásmido.
Clasificaciones y tipos
Los plásmidos pueden clasificarse de varias maneras. Los plásmidos se pueden clasificar ampliamente en plásmidos conjugativos y plásmidos no conjugativos.
Los plásmidos conjugativos contienen un conjunto de genes de transferencia o TRA que promueven la conjugación sexual entre diferentes células.
En el complejo proceso de conjugación, el plásmido puede transferirse de una bacteria a otra a través de pili sexual codificado por algunos de los genes TRA.
Los plásmidos no conjugativos son incapaces de iniciar la conjugación, por lo tanto, pueden transferirse solo con la ayuda de plásmidos conjugativos.
Una clase intermedia de plásmidos es movilizable y lleva solo un subconjunto de los genes necesarios para la transferencia.
Los plásmidos también se pueden clasificar en grupos de incompatibilidad. Un microbio puede albergar diferentes tipos de plásmidos, sin embargo, diferentes plásmidos solo pueden existir en una sola célula bacteriana si son compatibles.
Si dos plásmidos no son compatibles, uno u otro se perderán rápidamente de la célula. Por lo tanto, diferentes plásmidos pueden asignarse a diferentes grupos de incompatibilidad dependiendo de si pueden coexistir juntos.
Los plásmidos incompatibles (que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad) normalmente comparten los mismos mecanismos de replicación o partición y, por lo tanto, no pueden mantenerse juntos en una sola célula.
Otra forma de clasificar plásmidos es por función:
Fertilidad F-plásmidos: que contienen genes TRA. Son capaces de conjugarse y dan como resultado la expresión de pili sexual.
Col plásmidos: que contienen genes que codifican bacteriocinas, proteínas que pueden matar a otras bacterias.
Plásmidos degradativos: que permiten la digestión de sustancias inusuales, p. tolueno y ácido salicílico.
Vectores
Los plásmidos construidos artificialmente se pueden usar como vectores en ingeniería genética. Una amplia variedad de plásmidos están disponibles comercialmente para tales usos.
El gen que se va a replicar normalmente se inserta en un plásmido que normalmente contiene una serie de características para su uso.
Estos incluyen un gen que confiere resistencia a antibióticos particulares (la ampicilina se usa con mayor frecuencia para cepas bacterianas).
Un origen de replicación para permitir que las células bacterianas repliquen el ADN del plásmido y un sitio adecuado para la clonación (denominado sitio de clonación múltiple).
Clonación
Los plásmidos son los vectores de clonación bacterianos más comúnmente utilizados.
Estos vectores de clonación contienen un sitio que permite insertar fragmentos de ADN, por ejemplo, un sitio de clonación múltiple o un polienlazador que tiene varios sitios de restricción usados comúnmente a los que se pueden ligar fragmentos de ADN.
Estos plásmidos contienen un marcador seleccionable, generalmente un gen de resistencia a antibióticos, que confiere a las bacterias una capacidad para sobrevivir y proliferar en un medio de crecimiento selectivo que contiene los antibióticos particulares.
Las células después de la transformación se exponen a los medios selectivos, y solo las células que contienen el plásmido pueden sobrevivir.
De esta manera, los antibióticos actúan como un filtro para seleccionar solo las bacterias que contienen el ADN del plásmido.
El vector también puede contener otros genes marcadores o genes informadores para facilitar la selección del plásmido con el inserto clonado.
Las bacterias que contienen el plásmido se pueden cultivar luego en grandes cantidades, se pueden cosechar, y el plásmido de interés se puede aislar entonces usando varios métodos de preparación de plásmido.
Un vector de clonación de plásmido se usa típicamente para clonar fragmentos de ADN de hasta 15 kbp.
Para clonar longitudes más largas de ADN, se eliminan los fagos lambda con genes de lisogenia, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos o cromosomas artificiales de levadura.
Producción de proteínas
Otro uso importante de los plásmidos es producir grandes cantidades de proteínas.
Terapia de genes
El plásmido también se puede usar para la transferencia de genes en células humanas como tratamiento potencial en terapia génica para que pueda expresar la proteína que falta en las células.
Algunas estrategias de terapia génica requieren la inserción de genes terapéuticos en sitios diana cromosómicos preseleccionados dentro del genoma humano. Los vectores plasmídicos son uno de los muchos enfoques que podrían usarse para este propósito.
Las nucleasas con dedos de zinc (ZFNs) ofrecen una manera de causar una rotura de doble cadena específica del sitio al genoma de ADN y causar recombinación homóloga.
Los plásmidos que codifican la nucleasa de dedo de cinc podrían ayudar a administrar un gen terapéutico a un sitio específico para evitar el daño celular, las mutaciones causantes de cáncer o una respuesta inmune.
Modelos de enfermedades
Los plásmidos se utilizaron históricamente para diseñar genéticamente las células madre embrionarias de ratas con el fin de crear modelos de enfermedades genéticas de ratas.
La eficacia limitada de las técnicas basadas en plásmidos impidió su uso en la creación de modelos de células humanas más precisos.
Sin embargo, los avances en las técnicas de recombinación de virus adenoasociadas y las nucleasas de dedos de cinc han permitido la creación de una nueva generación de modelos de enfermedades humanas isogénicas.
Episodios
El término episoma fue introducido por François Jacob y Élie Wollman en 1958 para referirse al material genético extracromosómico que puede replicarse de manera autónoma o integrarse en el cromosoma.
Desde que se introdujo el término, sin embargo, su uso ha cambiado ya que el plásmido se ha convertido en el término preferido para la replicación autónoma del ADN extracromosómico.
En un simposio de 1968 en Londres, algunos participantes sugirieron que se abandonara el término episome, aunque otros continuaron usando el término con un cambio en el significado.
Hoy en día, algunos autores usan episomas en el contexto de los procariotas para referirse a un plásmido que es capaz de integrarse en el cromosoma.
Los plásmidos integradores se pueden replicar y mantener de manera estable en una célula a través de múltiples generaciones, pero siempre en alguna etapa existen como una molécula de plásmido independiente.
En el contexto de eucariotas, el término episomes se usa para referirse a una molécula circular de ADN extracromosómica cerrada no integrada que puede replicarse en el núcleo.
Los virus son los ejemplos más comunes de esto, como herpesvirus, adenovirus y poliomavirus, pero algunos son plásmidos.
Otros ejemplos incluyen fragmentos cromosómicos aberrantes, tales como cromosomas de doble minuto, que pueden surgir durante amplificaciones de genes artificiales o en procesos patológicos (por ejemplo, transformación de células cancerosas).
Los episomas en eucariotas se comportan de forma similar a los plásmidos en procariotas en que el ADN se mantiene estable y se replica con la célula huésped.
Los episomas virales citoplásmicos (como en las infecciones por poxvirus) también pueden ocurrir.
Algunos episomas, como los herpesvirus, se replican en un mecanismo de círculo rodante, similar al virus del fago bacteriano. Otros se replican a través de un mecanismo de replicación bidireccional (plásmidos tipo Theta).
En cualquier caso, los episomas permanecen físicamente separados de los cromosomas de la célula huésped.
Varios virus del cáncer, incluido el virus de Epstein-Barr y el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, se mantienen como episomas latentes, cromosómicamente distintos en las células cancerosas, donde los virus expresan oncogenes que promueven la proliferación de las células cancerígenas.
En los cánceres, estos episomas se replican pasivamente junto con los cromosomas del huésped cuando la célula se divide.
Cuando estos episomas virales inician la replicación lítica para generar múltiples partículas de virus, en general activan mecanismos de defensa de inmunidad celular innata que matan a la célula huésped.
Mantenimiento de plásmidos
Algunos plásmidos u hospedadores microbianos incluyen un sistema de adicción o un sistema de muerte postsegregacional (PSK), tal como el sistema hok/sok (que mata/supresor de muerte) del plásmido R1 en Escherichia coli.
Esta variante produce tanto un veneno de larga duración como un antídoto de vida corta.
Varios tipos de sistemas de adicción de plásmidos (toxina/antitoxina, basados en el metabolismo, sistemas de ORT) se describieron en la literatura y se usaron en aplicaciones biotécnicas (fermentación) o biomédicas (terapia de vacunas).
Finalmente, la productividad general podría mejorarse.
Por el contrario, prácticamente todos los plásmidos utilizados biotecnológicamente (tales como pUC18, pBR322 y vectores derivados) no contienen sistemas de adicción a toxinas y antitoxinas y, por lo tanto, deben mantenerse bajo presión antibiótica para evitar la pérdida de plásmidos.
Plásmidos de levadura
Las levaduras albergan naturalmente varios plásmidos.
Entre ellos se destacan los plásmidos de 2 μm (pequeños plásmidos circulares utilizados a menudo para la ingeniería genética de la levadura) y los plásmidos pGKL lineales de Kluyveromyces lactis, que son responsables de los fenotipos asesinos.
Otros tipos de plásmidos a menudo están relacionados con vectores de clonación de levadura que incluyen:
- Plásmido integrador de levadura (YIp), vectores de levadura que dependen de la integración en el cromosoma del huésped para la supervivencia y la replicación, y se usan generalmente cuando se estudia la funcionalidad de un solo gen o cuando el gen es tóxico.
- También está relacionado con el gen URA3, que codifica una enzima relacionada con la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina (T, C).
- Plásmido replicativo de levadura (YRp), que transporta una secuencia de ADN cromosómico que incluye un origen de replicación. Estos plásmidos son menos estables, ya que pueden perderse durante la gemación.
Extracción de ADN plasmídico
Como se mencionó anteriormente, los plásmidos se usan a menudo para purificar una secuencia específica, ya que pueden purificarse fácilmente del resto del genoma.
Existen varios métodos para aislar el ADN plasmídico de las bacterias, cuyos arquetipos son miniprep y maxiprep/bulkprep.
El primero se puede usar para descubrir rápidamente si el plásmido es correcto en cualquiera de varios clones bacterianos.
El rendimiento es una pequeña cantidad de ADN de plásmido impuro, que es suficiente para el análisis por digestión de restricción y para algunas técnicas de clonación.
En este último, se producen volúmenes mucho mayores de suspensión bacteriana a partir de los cuales se puede realizar una maxi-preparación. En esencia, se trata de una minipreparación a escala seguida de una purificación adicional.
Esto da como resultado cantidades relativamente grandes (varios cientos de microgramos) de ADN de plásmido muy puro.
Conformaciones
El ADN mellado de circular abierta tiene un corte de hebra.
El ADN circular relajado está completamente intacto con ambas hebras sin cortar, pero se ha relajado enzimáticamente (se han quitado las superbrondas).
Esto se puede modelar dejando que un cordón de extensión retorcido se desenrolle y relaje y luego lo tape en sí mismo.
El ADN superenrollado (o circular cerrado covalentemente) está completamente intacto con ambas hebras sin cortar, y con un giro integral, dando como resultado una forma compacta. Esto se puede modelar al retorcer un cable de extensión y luego enchufarlo en sí mismo.
El ADN desnaturalizado superenrollado es como el ADN superenrollado, pero tiene regiones desapareadas que lo hacen un poco menos compacto; esto puede ser el resultado de una alcalinidad excesiva durante la preparación del plásmido.
La velocidad de migración para pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado a bajos voltajes.
A voltajes más altos, los fragmentos más grandes migran a tasas continuamente crecientes pero diferentes. Por lo tanto, la resolución de un gel disminuye con el aumento de voltaje.
A un voltaje bajo especificado, la velocidad de migración de pequeños fragmentos lineales de ADN es una función de su longitud.
Los grandes fragmentos lineales (más de 20 kb o menos) migran a una cierta tasa fija independientemente de la longitud.
Esto se debe a que las moléculas «respetan», y la mayor parte de la molécula sigue el extremo principal a través de la matriz del gel.
Los resúmenes de restricción se usan frecuentemente para analizar plásmidos purificados. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas.
Los fragmentos lineales resultantes forman ‘bandas’ después de la electroforesis en gel. Es posible purificar ciertos fragmentos cortando las bandas del gel y disolviendo el gel para liberar los fragmentos de ADN.
Debido a su conformación ajustada, el ADN superenrollado migra más rápidamente a través de un gel que el ADN lineal o circular abierto.
Software para bioinformática y diseño
El uso de plásmidos como técnica en biología molecular está respaldado por el software de bioinformática.
Estos programas registran la secuencia de ADN de vectores plasmídicos, ayudan a predecir los sitios de corte de las enzimas de restricción y planifican las manipulaciones.
Ejemplos de paquetes de software que manejan mapas de plásmidos son ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI y WebDSV.
Este software ayuda a realizar experimentos completos en silico antes de realizar experimentos húmedos.
Colecciones de plásmidos
Se han creado muchos plásmidos a lo largo de los años y los investigadores han distribuido plásmidos a bases de datos de plásmidos, como las organizaciones sin fines de lucro Addgene y BCCM/LMBP.
Uno puede encontrar y solicitar plásmidos de esas bases de datos para continuar la investigación.
El investigador también suele cargar secuencias de plásmidos en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Usando el Centro Nacional de Biotecnología, se pueden buscar secuencias de bases de datos de plásmidos específicos.
