Se compone de aminoácidos individuales que están unidos por un enlace covalente, llamado enlace peptídico, durante el proceso de traducción de proteínas.
Las proteínas se traducen y degradan constantemente en la célula para asegurar concentraciones adecuadas de proteína funcional para completar diversas funciones celulares.
El proceso de degradación de proteínas, denominado proteolisis, descompone las proteínas en aminoácidos individuales. La proteólisis se lleva a cabo mediante proteasas, un tipo de enzima cuyo mecanismo depende de la clase particular de proteasa.
Estas desempeñan muchas funciones importantes en la célula, incluida la coagulación de la sangre, la digestión de los alimentos, la apoptosis y la autofagia.
Estos procesos son vitales y, por lo tanto, las proteasas deben funcionar de manera eficiente para garantizar la supervivencia de los organismos.
Hay muchos tipos diferentes en cada célula de cada organismo, y estas enzimas funcionan en diversas regiones de la célula, con diferentes especificidades y mecanismos de acción.
Proteólisis en el Aislamiento de proteínas
La actividad proteasa está altamente regulada en la célula, y esta regulación se produce a través de una variedad de mecanismos.
Un ejemplo de activación de proteasa regulada es durante el inicio de la apoptosis o muerte celular programada. La activación de la caspasa y la escisión posterior de las proteínas aguas abajo juegan un papel importante en la apoptosis.
La mayoría de las caspasas celulares existen como una procaspasa (una versión inactiva) que debe escindirse proteolíticamente para exhibir actividad de proteasa.
Las proteínas en el IAP (inhibidor de la apoptosis) bloquean la apoptosis de la familia ya sea impidiendo la escisión de una procaspasa o inhibiendo directamente la actividad de la caspasa.
La actividad de las proteasas también se puede controlar mediante su localización celular. Algunas proteasas son secuestradas dentro de orgánulos específicos de tal manera que solo pueden degradar las proteínas que están dirigidas a esas mismas ubicaciones celulares.
Por ejemplo, las catepsinas son proteasas predominantemente localizadas en los lisosomas. Estas proteasas degradan las proteínas que están dirigidas a los lisosomas para la degradación.
En las células intactas, las proteínas no localizadas en los lisosomas no entran en contacto con estas proteasas particulares y, por lo tanto, no pueden ser proteolizadas por las catepsinas.
Cuando las células se lisan, los mecanismos reguladores se interrumpen y los orgánulos se pueden romper. Las proteasas que normalmente no entran en contacto con la mayoría de las proteínas ya no están secuestradas.
Además, los mecanismos celulares de la inhibición de la proteasa se alteran, de modo que las proteasas activas podrían escindir una variedad de proteínas sobre las que no actúan en las células intactas.
Debido al gran número y tipo de proteasas en los organismos comúnmente utilizados para la expresión de proteínas, es fácil imaginar que las proteínas puedan estar sujetas a una extensa proteólisis tras la lisis celular.
Por lo tanto, es necesario tomar medidas para prevenir la proteolisis de las proteínas durante su purificación, de modo que se aisle la proteína funcional de longitud completa para su uso en estudios experimentales.
Los inhibidores de la proteasa se usan generalmente en estos tipos de estudios, y el tipo de inhibidor que se debe usar depende del tipo de proteasa que se necesita inhibir.
Clasificación de Proteasa
Las proteasas se caracterizan de muchas maneras diferentes. Las proteasas se pueden clasificar por su mecanismo de acción y su especificidad de sustrato.
Clasificación General
En términos generales, las proteasas se pueden caracterizar como endopeptidasas o exopeptidasas:
- Las endopeptidasas escinden enlaces dentro de la proteína y generalmente son muy específicas para secuencias de aminoácidos particulares.
- Las exopeptidasas escinden un solo aminoácido del extremo de una proteína, y son menos específicas hacia el aminoácido que se está escindiendo.
Las exopeptidasas se clasifican a sí mismas como aquellas que se unen solo desde el extremo C (carboxipeptidasas), solo desde el extremo N (aminopeptidasas), o ambas terminales (dipeptidasas).
Ambas endopeptidasas y exopeptidasas pueden ser muy problemáticas durante la purificación de proteínas. Las endopeptidasas pueden reconocer regiones en la proteína de interés y realizar proteolisis para digerir la proteína en muchas piezas más pequeñas que son inútiles en estudios experimentales.
Las exopeptidasas también pueden ser muy problemáticas durante la purificación, y la eliminación de solo unos pocos aminoácidos a menudo no es detectable por métodos comunes.
Mecanismo de Proteólisis
Las proteasas también se caracterizan por su mecanismo de acción; es decir, los aminoácidos que están implicados en el sitio catalítico de la enzima.
El sitio catalítico contiene los aminoácidos que juegan directamente un papel en la facilitación de la hidrólisis del enlace peptídico. Este proceso requiere un nucleófilo para iniciar la reacción, que puede ser una cadena lateral de aminoácido de sitio activo o una molécula de agua.
Durante las últimas etapas de la proteolisis, los dos péptidos se liberan y el sitio activo de la proteasa vuelve a su estado inicial, listo para unirse a otro sustrato para la proteólisis.
Las proteasas se agrupan típicamente en cuatro clases principales en función de sus residuos del sitio activo:
- Serina proteasas.
- Cisteína (tiol) proteasas.
- Aspártico proteasas.
- Metaloproteasas.
Las proteasas de serina y cisteína (tiol) tienen un aminoácido dentro del sitio activo que realiza el ataque nucleofílico inicial, mientras que las proteasas aspárticas y las metaloproteasas activan una molécula de agua para realizar el ataque nucleofílico inicial.
Las serina proteasas actúan a través de una tríada catalítica compuesta de una serina, una histidina y un residuo de aspartato.
Las cisteína (tiol) proteasas contienen una díada catalítica con una histidina y un residuo de cisteína. La cisteína realiza el ataque nucleofílico para iniciar la hidrólisis del enlace peptídico.
Las proteasas aspárticas contienen una díada catalítica con dos residuos de aspartato.
Las metaloproteasas requieren un ion de cinc (o, más raramente, un ion de metal divalente diferente) que se coordina con la proteína por tres aminoácidos, cuya identidad puede variar.
El ion de metal activa la molécula de agua, de modo que puede realizar un ataque nucleofílico sobre el carbono de carbonilo para romper el enlace peptídico.
Especificidad Del Enlace Peptídico
Las endoproteasas reconocen específicamente ciertos aminoácidos o tipos de aminoácidos. No solo son importantes los aminoácidos que forman el enlace peptídico, sino que también los residuos vecinos juegan un papel en la especificidad.
Este reconocimiento está mediado por bolsas de especificidad, regiones dentro de la proteasa alrededor del sitio activo que unen algunas cadenas laterales de aminoácidos más favorablemente que otras.
Las proteasas de tipo tripsina: predominantemente escinden proteínas en el lado carboxilo de arginina o lisina (excepto cuando ese residuo sigue a una prolina).
Las proteasas similares a la quimotripsina: prefieren fragmentarse en el lado carboxilo de los grandes residuos aromáticos (triptófano, tirosina o fenilalanina).
Las proteasas tipo caspasa: se separan predominantemente en el lado carboxilo del aspartato, pero se ha demostrado que una caspasa en Drosophila también se escinde en el lado carboxilo del glutamato.
Las proteasas de tipo elastasa: se separan predominantemente en el lado carboxilo de los aminoácidos alifáticos pequeños (glicina, alanina o valina).
Inhibidores de la Proteasa
Los inhibidores de la proteasa son moléculas que bloquean la actividad de las proteasas y típicamente funcionan en clases de proteasas con mecanismos de acción similares.
Los inhibidores de la proteasa pueden estar en forma de proteínas, péptidos o moléculas pequeñas. Los inhibidores de proteasa que ocurren naturalmente son generalmente proteínas o péptidos.
Los inhibidores de proteasa usados en estudios experimentales o desarrollo de fármacos a menudo son moléculas similares a péptidos sintéticos o pequeñas.
Muchos inhibidores de proteasa diferentes están disponibles comercialmente para usar experimentalmente tanto en ensayos in vitro como in vivo y durante la purificación de proteínas.
Mecanismo de inhibición de la Proteasa
Los inhibidores de la proteasa pueden funcionar de diferentes maneras para inhibir la acción de las proteasas. Estos inhibidores se pueden clasificar por el tipo de proteasa que inhiben y el mecanismo por el cual inhiben la enzima.
Mientras que los inhibidores de la proteasa se venden comercialmente según la clase de proteasa que inhiben, comprender los diversos mecanismos por los que funcionan los inhibidores es importante para una comprensión exhaustiva de la inhibición y para desarrollar inhibidores de la proteasa como estrategia terapéutica.
Los inhibidores reversibles generalmente se unen a la proteasa con múltiples interacciones no covalentes, sin ninguna reacción del inhibidor en sí mismo. Estos inhibidores se pueden eliminar por dilución o diálisis.
Los inhibidores reversibles incluyen inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos e inhibidores no competitivos. Los inhibidores competitivos se unen al sitio activo de la proteasa, compitiendo con los sustratos por el acceso a los residuos del sitio activo.
Un ejemplo de un inhibidor competitivo es la aprotinina, que inhibe muchas serina proteasas. Los inhibidores competitivos a menudo tienen una estructura similar al estado de transición de los sustratos naturales.
El estado de transición del sustrato es la estructura que se une más estrechamente con la enzima. Por lo tanto, los compuestos que imitan esta estructura se unen a la enzima con una mayor resistencia que el sustrato (en su estado inicial) puede, y la reacción enzimática normal no puede continuar.
Un ejemplo de este tipo de análogo de estado de transición es LP-130, un inhibidor de proteasa de VIH-1.
Los inhibidores no competitivos se unen solo a la proteasa cuando ya está unida a un sustrato. Se han identificado inhibidores para la proteasa del VIH-1 y la proteinasa NS2B-NS3 del virus del Nilo Occidental que funcionan de manera no competitiva.
Los inhibidores no competitivos se unen a la proteasa, con o sin sustrato unido, con afinidades similares, e inhiben la actividad de la proteasa a través de un mecanismo alostérico. BBI, un inhibidor de la tripsina de la soja y los aminoglucósidos, inhibidores de la proteasa del factor mortal del ántrax no son competitivos.
Los inhibidores irreversibles funcionan alterando específicamente el sitio activo de su objetivo específico a través de la formación de enlaces covalentes.
Tras la unión al inhibidor, el sitio activo de la proteasa está alterado y ya no puede realizar la hidrólisis del enlace peptídico. Algunos inhibidores no se unen covalentemente a la proteasa, sino que interactúan con una afinidad tan alta que no se eliminan fácilmente.
Un ejemplo de un inhibidor de proteasa suicida es la familia de proteínas serpin, que desempeñan un papel en la coagulación y la inflamación de la sangre. Un ciclo en Serpin sirve como un sustrato análogo.
El residuo de serina en el sitio activo de tripsina forma un ataque nucleofílico sobre un carbono carbonílico del análogo del sustrato, induciendo un cambio conformacional en la enzima que hace que el resto de la reacción de hidrólisis del enlace peptídico sea desfavorable.
Por lo tanto, la serpina permanece unida covalentemente a la proteasa de modo que la enzima ya no está disponible para unirse a los sustratos.
Tipos de inhibidores de Proteasa
Los inhibidores de proteasa se pueden comprar individualmente o como un cóctel concentrado que contiene múltiples inhibidores de proteasa en cantidades relativas apropiadas.
Los inhibidores de proteasa individuales son ideales para situaciones en las que se necesita un inhibidor de proteasa para su uso en ensayos proteolíticos de proteínas ya purificadas.
Muchas veces, los ensayos enzimáticos requieren un control para mostrar que la enzima de interés está realizando la acción supervisada; por lo tanto, agregar un inhibidor de proteasa específico puede servir adecuadamente como control.
La compra de inhibidores de proteasa individuales también es ideal en circunstancias en las que la proteína que se purifica es una proteasa. En estos casos, la presencia de proteína funcional y la pureza a menudo se evalúa mediante ensayos enzimáticos.
Para este tipo de purificación, se pueden agregar múltiples inhibidores de proteasa, con exclusión de aquellos que inhiben la proteasa de interés. La mayoría ofrece una inhibición amplia de una o más clases de proteasas.
Los cócteles inhibidores de la proteasa a menudo se utilizan por su fiabilidad y reproducibilidad. Los cócteles contienen proteasas múltiples en las cantidades relativas apropiadas, eliminando la necesidad de prueba y error para determinar los tipos requeridos y las cantidades de inhibidores que se deben usar.
También minimizan la posibilidad de error humano y de pipeteo, al requerir solo una solución frente a múltiples soluciones diferentes. Estos cócteles vienen en formas líquidas y sólidas.
Las tabletas Roche cOmplete son uno de los cócteles inhibidores de la proteasa más comúnmente utilizados. Estas tabletas se agregan a un volumen específico de tampón para inhibir las proteasas más abundantes.
Se ha demostrado que las tabletas Roche cOmplete inhiben con éxito una amplia gama de proteasas en lisados de muchos organismos, incluidos E. coli, levadura, insectos y mamíferos.
El rendimiento de proteína de longitud completa en ausencia de inhibidores de proteasa es menos de la mitad del obtenido con la adición de inhibidores de proteasa.
Los inhibidores de la proteasa en forma de tableta se agregan a un volumen indicado de tampón, y las tabletas se disuelven para llevar la concentración de cada inhibidor de proteasa en el tampón a los niveles apropiados.
La adición de inhibidores de proteasa en forma de tableta es muy conveniente, ya que no se requiere pipeteo.
En los casos en que se requieren volúmenes muy pequeños de tampón, los cócteles inhibidores de proteasa en forma líquida podrían ser más adecuados para evitar el desperdicio del exceso de tampón, ya que las tabletas requieren la preparación de un volumen determinado.
Muchas compañías también venden inhibidores de proteasa individualmente, como cócteles, y como conjuntos de múltiples inhibidores individuales. Estos conjuntos son útiles para determinar qué inhibidores de proteasa son necesarios para una determinada aplicación.
También pueden ser útiles cuando se sabe que un determinado inhibidor de proteasa incluido en la mayoría de los cócteles comerciales interfiere con la proteína de interés o la aplicación aguas abajo.
Inhibidores de Proteasa en Acción
Hay muchas cosas a tener en cuenta al elegir el (los) inhibidor (es) de proteasa apropiado (s).
La consideración más importante es el propósito de la inhibición de la proteasa, si se necesitan inhibidores para evitar la proteólisis durante la purificación de la proteína, para inhibir una enzima purificada como control experimental o para que el uso en organismos vivos afecte procesos fisiológicos.
La siguiente sección incluye algunas preguntas e inquietudes importantes a tener en cuenta al usar inhibidores de la proteasa.
¿Qué inhibidor de proteasa debería usarse?
La aplicación juega un papel importante en el tipo de inhibidor de proteasa que se debe usar.
Para ensayos in vitro e in vivo, la elección del inhibidor de proteasa depende de la enzima particular o del proceso fisiológico que se esté estudiando. Para los ensayos enzimáticos, el inhibidor no debe interferir con el método de detección.
Aunque si la inhibición es reversible, y está disponible otro método de detección (por ejemplo, elisa), puede no importar si la proteína diana se inhibe durante la purificación con tal que el inhibidor esté ausente de la preparación final.
Cabe señalar que algunos inhibidores de la proteasa no son específicos para las proteasas. Por ejemplo, PMSF inhibe irreversiblemente a muchos, pero no a todos, los miembros de la familia de serina hidrolasa.
Esta familia, aunque incluye proteasas tales como tripsina y quimotripsina, también incluye muchas otras enzimas que hidrolizan sustratos no proteicos (por ejemplo, acetil-colinesterasas, acil-CoA hidrolasas y lipasas).
Para estudios en organismos vivos, el inhibidor debe ser permeable a las células, altamente específico y no tóxico. Para la inhibición amplia de las proteasas para ayudar a purificar la proteína funcional de longitud completa, típicamente se requieren proteasas múltiples.
¿Cómo deberían prepararse y almacenarse los Inhibidores de la Proteasa?
Muchos inhibidores de la proteasa son inestables durante largos períodos de tiempo, ya sea como una solución madre o en su concentración de trabajo.
Es muy importante preparar las soluciones de acuerdo con las instrucciones del proveedor, ya que algunos inhibidores de la proteasa son más estables que otros en ciertas condiciones.
Típicamente, si las soluciones madre se han almacenado como sugeridas y las soluciones de trabajo se prepararon inmediatamente antes del uso, los inhibidores deberían conservar suficiente función.
Algunos inhibidores de la proteasa, como PMSF, son muy inestables y se deben agregar varias veces durante la lisis y la purificación para asegurar la inhibición de la proteasa.
¿Cómo se puede confirmar la función de los Inhibidores de la Proteasa?
Varias compañías venden reactivos como una medida para verificar la función de la proteasa, y estos pueden usarse para confirmar una inhibición adecuada.
Roche vende un sustrato de proteasa universal, que utiliza un ensayo de absorbancia para controlar la degradación de caseína marcada con resorufina. Este sustrato se puede usar si hay evidencia de sospecha de inhibición inadecuada de la proteasa.
Típicamente, es un mejor uso de tiempo y energía simplemente hacer una solución de inhibidor de proteasa fresca si se sospecha que las proteasas aún son funcionales.
Sin embargo, si la proteólisis es un problema recurrente, estos sustratos comerciales pueden ayudar a determinar las condiciones más apropiadas para la inhibición de la proteasa.
Durante la lisis celular y la purificación de proteínas, ¿cuándo se deben agregar los Inhibidores de la Proteasa?
Los inhibidores de la proteasa deben agregarse al tampón de lisis para que la inhibición pueda ocurrir inmediatamente después de la lisis celular, cuando las proteasas se liberan de sus compartimentos celulares y se interrumpe la regulación.
Estos inhibidores de proteasa deben permanecer en los tampones tempranos utilizados en el esquema de purificación hasta que se pueda suponer que la mayoría de las proteasas contaminantes se han separado suficientemente de la proteína de interés.
Típicamente, si la primera etapa cromatográfica es rigurosa (por ejemplo, cromatografía de afinidad), los inhibidores de proteasa solo necesitan estar presentes a través de la etapa de lavado de este procedimiento cromatográfico.
El tampón de elución y los tampones de purificación restantes habitualmente no requieren inhibidores de proteasa.
Esta es una consideración financiera importante para los esfuerzos de purificación de proteínas a gran escala donde pueden requerirse grandes cantidades de tampones.
Incluso para un laboratorio industrial bien financiado, la inclusión de altas concentraciones de inhibidores de la proteasa a lo largo de las purificaciones a gran escala puede ser prohibitivamente costosa.
Sin embargo, muchas proteasas son catalizadores muy eficientes con altos números de renovación y, por lo tanto, si incluso una pequeña cantidad de una proteasa se co-purifica con la proteína diana, puede causar problemas.
Esto puede presentarse como una degradación obvia de la proteína diana o puede no ser aparente hasta que el análisis N-terminal o espectroscópico de masas revele que la preparación de proteína purificada contiene una variedad de especies con diferentes extremos N-terminales.
Para muchas aplicaciones, tal microheterogeneidad puede no ser un problema, mientras que para otros puede causar problemas significativos.
Por ejemplo, en un contexto de biología estructural, tal heterogeneidad N-terminal puede afectar la capacidad de cristalizar una proteína y/o la calidad de cualquier cristal obtenido.
Por lo tanto, en algunos casos puede ser necesario incluir inhibidores contra una o más clases de proteasa en las etapas posteriores del protocolo de purificación.
El uso de ensayos de proteasa (como se discutió anteriormente) se puede usar para identificar la clase de proteasa que debe bloquearse.
¿Qué más se puede hacer para frenar la Proteólisis?
La lisis celular y la purificación deben realizarse a baja temperatura. Típicamente, la lisis y la purificación se realizan a 4°C. Esto no solo ayuda con el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, sino que también ralentiza la tasa de proteólisis al contaminar las proteasas.
Además, cuanto más rápido se eliminan las proteasas contaminantes de la proteína de interés, menos tiempo tienen para interactuar y posiblemente degradar la proteína. No permita que los lisados de las células se sienten alrededor, incluso en el hielo, durante largos períodos de tiempo.
Continúe con los pasos de purificación lo más rápido posible y almacene la proteína purificada de manera apropiada.
Si la proteólisis de una proteína recombinante es un problema particular, se pueden considerar una serie de enfoques. Para la expresión de E. coli, es posible que la disminución de la temperatura de crecimiento reduzca la proteólisis de la proteína diana que se produce antes de la cosecha y lisis celular.
También puede ser posible reducir la proteólisis intracelular de la proteína diana dirigiendo la expresión al periplasma y reduciendo así la exposición a las proteasas intracelulares.
De manera similar, para evitar la proteolisis por proteasas de mamífero intracelulares, puede ser posible usar un sistema de expresión que dirija la secreción de la proteína recombinante al medio de cultivo.
Considerando el diferente rango de proteasas producidas por diferentes organismos, también puede ser posible reducir, o incluso eliminar, problemas de proteólisis cambiando la expresión a un organismo huésped diferente (por ejemplo, E. coli a células de baculovirus/insecto).
Si no sé qué inhibidores de la proteasa debo usar, ¿dónde debo comenzar?
El mejor lugar para comenzar en la elección de la combinación correcta de inhibidores para su uso durante la lisis celular y la purificación de proteínas es probar un cóctel de inhibidores de uso común. Para la mayoría de los lisados y aplicaciones, estos son suficientes.
Sin embargo, si no se obtiene proteína de longitud completa o si se experimentan problemas en las aplicaciones posteriores, se pueden usar inhibidores de proteasa individuales o conjuntos de inhibidores de proteasa para determinar la combinación más apropiada de inhibidores de proteasa.
Inhibidores de la Proteasa en la Práctica Clínica
Los inhibidores se probaron en varios ensayos clínicos.
En particular, varios subtipos estructurales de inhibidores de triptasa (TI) muestran efectos terapéuticos prometedores para las enfermedades pulmonares. Los mecanismos de sus acciones incluyen la unión covalente de residuos de serina en los dominios activos o el aspartato de unión y la formación de enlaces de hidrógeno.
Se demostró que los TI basados en sulfenamida bencénica suprimían eficazmente las reacciones alérgicas pulmonares, como el broncoespasmo agudo, en modelos animales.
Los TI que contienen dipéptidos fueron efectivos para disminuir tanto la patología mediada por el asma como la fibrosis hepática.
Además, los TI basados en guanidino se probaron como un tratamiento adicional para la colitis ulcerosa. Además, el TIS que contiene beta-lactama se puede usar para disminuir la inflamación pulmonar.
Con respecto a las enfermedades cardiovasculares, se demostró que los supresores de convertasa subtilsin-kexin tipo 9 disminuían las lipoproteínas de baja densidad y se aprobaban para el tratamiento de pacientes con hiperlipidemia grave.
Además, los supresores de dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) pueden disminuir de manera efectiva los niveles de glucosa y se usan para el tratamiento de pacientes con diabetes tipo 2.
Además, se demostró que el inhibidor de DPP-4 linagliptina suprime el desarrollo de la retinopatía diabética en un modelo experimental.
Además, los inhibidores de la cisteína proteasa catepsina K aumentan la densidad mineral ósea en individuos con osteoporosis posmenopáusica. Además, el sudator catepsina K odanacatib disminuyó la resorción ósea en pacientes masculinos y femeninos con osteoporosis.
