Su invención se remonta al siglo XIV al arte italiano de las lentes para gafas.
Esta tecnología fue retomada por los fabricantes de lentes holandeses Hans y Zacharias Janssen en 1590 para hacer el primer microscopio colocando dos lentes en un tubo.
En 1675, Anton van Leeuwenhoek utilizó un microscopio simple con una sola lente para examinar la sangre con todo detalle y se convirtió en la primera persona en describir las células, los glóbulos rojos que transportan el oxígeno por todo el cuerpo.
A lo largo de los siglos, los microscopios han sido esenciales para el desarrollo de la investigación inmunológica, pero tal vez el momento más formativo llegó en 1878 cuando Paul Ehrlich, un joven científico de Strzelin en Polonia describió en su tesis doctoral el descubrimiento de un nuevo constituyente de la sangre que llamó células cebadas.
Descubrió que el protoplasma granulado de lo que se pensaba que eran simplemente células plasmáticas podía hacerse visible bajo un microscopio añadiendo un colorante alcalino.
Pensó que estas células granuladas eran un signo de buena nutrición, por lo tanto, las llamó por la palabra alemana para un alimento para engorde de animales llamado Mast.
De hecho, con la ayuda de su microscopio, Ehrlich descubrió un tipo de célula clave que pertenece al sistema inmune humano, el primero de muchos.
Ahora se sabe que los mastocitos liberan histamina y otras sustancias durante las reacciones inflamatorias y alérgicas.
El interés de Ehrlich en los tintes microscópicos que podrían teñir diferencialmente los tejidos también lo llevaron a ser la primera persona en distinguir entre los linfocitos y los leucocitos, los dos principales grupos de glóbulos blancos, elementos vitales en el sistema inmune.
Su trabajo condujo a un premio Nobel en 1908 en reconocimiento a su trabajo en inmunología y en su conferencia de aceptación reconoció la importancia del microscopio en la comprensión de la vida.
Posteriormente otros avances en el etiquetado, como la inmunofluorescencia, y en la tecnología microscópica, como el microscopio electrónico y el microscopio de barrido, arrojaron aún más luz sobre el complejo funcionamiento del sistema inmune.
El microscopio, es un instrumento que produce imágenes ampliadas de objetos pequeños, lo que permite al observador una visión muy cercana de estructuras diminutas a una escala conveniente para el examen y el análisis.
El microscopio puede proporcionar una imagen dinámica (como con instrumentos ópticos convencionales) o una que sea estática (como con los microscopios electrónicos de barrido).
El poder de aumento de un microscopio es una expresión de la cantidad de veces que el objeto que se está examinando parece agrandado y es una relación adimensional.
Generalmente se expresa en la forma 10 × (para una imagen ampliada 10 veces).
La resolución de un microscopio es una medida del más pequeño detalle del objeto que se puede observar.
La resolución se expresa en unidades lineales, generalmente micrométricas (μm).
Tipos de microscopios
El tipo de microscopio más común es el microscopio óptico o liviano, en el que se usan lentes de vidrio para formar la imagen.
Los microscopios ópticos pueden ser simples, consistentes en una única lente, o compuesto, que consiste en varios componentes ópticos en línea.
La lupa de mano puede aumentar de 3 a 20 ×. Los microscopios simples con una sola lente pueden aumentar hasta 300 × y son capaces mostrar bacterias.
Mientras que los microscopios compuestos pueden aumentar hasta 2,000 ×.
Un microscopio simple puede tener una resolución por debajo de 1 micrometro (μm, una millonésima de metro), un microscopio compuesto puede tener una resolución hasta aproximadamente 0,2 μm.
El microscopio compuesto, es también denominado microscopio de luz.
Existen otros microscopios alternativos como el microscopio de campo oscuro. Con este tipo de microscopio se puede observar un objeto claro en un fondo oscuro.
Es utilizado para la observación de espiroquetas vivas.
El microscopio de contraste de fase, puede mostrar claramente organismos vivos y que no se han teñidos y observarse las estructuras celulares internas como mitocondrias, lisosomas y cuerpo de Golgi.
En el microscopio fluorescente, se una usa luz ultravioleta como fuente de luz.
Las imágenes de interés pueden capturarse mediante la fotografía a través de un microscopio, una técnica conocida como fotomicrografía.
Desde el siglo XIX, esto se hizo con película, pero ahora se usa mucho la imagen digital.
Algunos microscopios digitales han prescindido de un ocular y proporcionan imágenes directamente en la pantalla de la computadora.
Otros tipos de microscopios usan la naturaleza de onda de varios procesos físicos.
El microscopio electrónico de transmisión tiene poderes de aumento de más de 1,000,000 × donde la fuente de energía que se utiliza es un haz de electrones.
Los microscopios electrónicos de transmisión forman imágenes de especímenes delgados.
Un microscopio electrónico de barrido, que crea una imagen reflejada de relieve en una muestra contorneada, generalmente tiene una resolución más baja que un microscopio electrónico de transmisión.
Pero puede mostrar superficies sólidas de una manera que el microscopio electrónico convencional no puede.
También hay microscopios que usan láseres, sonido o rayos X.
El microscopio de efecto túnel, que puede crear imágenes de átomos, y el microscopio electrónico de barrido ambiental, que genera imágenes usando electrones de especímenes en un entorno gaseoso, utilizan otros efectos físicos que amplían aún más los tipos de objetos que pueden ser examinado.
Varios tipos de microscopios están disponibles para su uso en el laboratorio de microbiología.
Los microscopios tienen diversas aplicaciones y modificaciones que contribuyen a su utilidad.
Componentes del microscopio
Platina
Una plataforma fija con una abertura en el centro permite el paso de la luz desde una fuente iluminada hacia abajo hasta el sistema de lentes sobre el escenario.
Esta plataforma proporciona una superficie para la colocación de una diapositiva con su espécimen sobre la abertura central.
Además de la etapa fija, la mayoría de los microscopios tienen una etapa mecánica que se puede mover vertical u horizontalmente mediante controles de ajuste.
Los microscopios menos sofisticados tienen clips en el escenario fijo, y el deslizador debe colocarse manualmente sobre la abertura central.
Iluminación
Algunos microscopios están equipados con una fuente de luz incorporada para proporcionar iluminación directa.
A otros se les proporciona un espejo; un lado plano y el otro cóncavo.
Una fuente de luz externa, como una lámpara, se coloca en frente del espejo para dirigir la luz hacia arriba en el sistema de lentes.
El lado plano del espejo se usa para la luz artificial y el lado cóncavo para la luz del sol.
Condensador
El condensador está ubicado debajo de la platina y posee juegos de lentes que concentran la luz que pasa desde la fuente de luz hasta el sistema de lentes.
El condensador está equipado con un diafragma de iris, un obturador controlado por una palanca que se utiliza para regular la cantidad de luz que ingresa al sistema de lentes.
Tubo
El tubo está ubicado sobre la platina y está sujeto al brazo del microscopio.
En esta estructura se encuentra el sistema de lentes que magnifica la preparación o muestra.
En el extremo superior del tubo se encuentra la lente ocular. La parte inferior consiste en un revólver móvil que contiene las lentes del objetivo.
Y permite la rotación de los objetivos de posición de la pieza ubicada sobre la abertura de la platina.
El tubo del cuerpo se puede subir o bajar con la ayuda de las perillas de ajuste grueso y ajuste fino que se encuentran por encima o por debajo de la platina, según el tipo y la marca del instrumento.
Principios teóricos de la microscopía
Para usar el microscopio de manera eficiente y con una frustración mínima, se deben comprender los principios básicos de la microscopía: aumento, resolución, apertura numérica, iluminación y enfoque.
Aumento
La ampliación o aumento de una muestra es la función de un sistema de dos lentes; la lente ocular se encuentra en el ocular y la lente del objetivo está situada en una pieza nasal giratoria.
Estas lentes están separadas por el tubo del cuerpo.
La lente del objetivo está más cerca de la muestra, produciendo la imagen real que se proyecta hacia arriba en el plano focal y luego magnificada por la lente ocular para producir la imagen final.
Los microscopios más comúnmente utilizados están equipados con un revólver porta objetivos que contiene cuatro lentes que poseen diferentes grados de aumento.
Cuando estos se combinan con la ampliación de la lente ocular, se obtiene la ampliación lineal total de la muestra.
Resolución
Aunque la ampliación es importante, se debe tener en cuenta que la ampliación ilimitada no es posible.
Simplemente se aumenta la potencia de aumento de las lentes o utilizando lentes adicionales, ya que las lentes están limitadas por una propiedad llamada poder de resolución.
Por definición, la capacidad de resolución es la capacidad de una lente para mostrar dos objetos adyacentes como entidades discretas.
Cuando una lente no puede discriminar, es decir, cuando los dos objetos aparecen como uno, pierde la resolución.
La resolución de la lente va a depender de la longitud de onda de la luz que se utiliza y de la apertura numérica.
La apertura numérica se define como una función del diámetro de la lente objetivo en relación con su distancia focal.
Se duplica con el uso del condensador de subestaciones; que ilumina el objeto con rayos de luz que pasan a través de la muestra oblicuamente, así como directamente.
Cuanto más corta sea la longitud de onda, mayor será el poder de resolución de la lente.
Por lo tanto, las longitudes de onda cortas del espectro electromagnético son más adecuadas que las longitudes de onda más largas en términos de la apertura numérica.
Sin embargo, al igual que con el aumento, el poder de resolución también tiene límites.
La relación entre la longitud de onda y la apertura numérica es válida solo para una mayor potencia de resolución cuando los rayos de luz son paralelos.
Por lo tanto, el poder de resolución depende de otro factor, el índice de refracción.
Este es el poder de flexión de la luz que pasa a través del aire desde el portaobjetos de vidrio a la lente del objetivo.
El índice de refracción del aire es más bajo que el del vidrio y, a medida que los rayos de luz pasan del cristal se deslizan hacia el aire, se doblan o se refractan para que no pasen a la lente del objetivo.
Esto causaría una pérdida de luz, lo que reduciría la apertura numérica y disminuiría la capacidad de resolución de la lente del objetivo.
La pérdida de luz refractada puede compensarse interponiendo aceite mineral, que tiene el mismo índice de refracción que el vidrio, entre el portaobjetos y la lente del objetivo.
De esta forma, se produce una disminución de la refracción de la luz y entran más rayos de luz directamente en la lente objetivo, produciendo una imagen vívida con alta resolución.
Iluminación
Se requiere una iluminación efectiva para un aumento y una potencia de resolución eficiente.
Dado que la intensidad de la luz del día es una variable incontrolada, la luz artificial de una lámpara de tungsteno es la fuente de luz utilizada más comúnmente en microscopía.
La luz pasa a través del condensador ubicado debajo de la platina. El condensador contiene dos lentes que son necesarios para producir una apertura numérica máxima.
La altura del condensador se puede ajustar con la perilla de condensación.
Mantenga siempre el condensador cerca del escenario, especialmente cuando usa el objetivo de inmersión en aceite.
Entre la fuente de luz y el condensador se encuentra el diafragma del iris, que se puede abrir y cerrar por medio de una palanca; por lo tanto, regula la cantidad de luz que ingresa al condensador.
La iluminación excesiva puede oscurecer la muestra debido a la falta de contraste.
La cantidad de luz que ingresa al microscopio difiere con cada lente objetivo utilizado.
Una regla empírica es que a medida que aumenta la magnificación de la lente, la distancia entre la lente objetivo y la diapositiva, denominada distancia de trabajo, disminuye, mientras que la apertura numérica de la lente del objetivo aumenta.
Uso y cuidado del microscopio
La forma correcta de mover un microscopio es agarrar firmemente el brazo del microscopio con la mano derecha y la base con la mano izquierda, y se coloca suavemente sobre el mesón de trabajo.
Esto evitará la colisión con muebles y protegerá el instrumento contra daños.
Una vez que el microscopio se va a utilizar se deben observar las siguientes reglas:
- Limpiar todos los sistemas de lentes: el menor trozo de polvo, aceite, pelusa o pestaña disminuirá la eficacia del microscopio.
- El ocular: las lentes de escaneo, de bajo consumo y de alta potencia pueden limpiarse, limpiándolas varias veces con un paño para lentes.
- No se debe usar papel o tela para limpiar la superficie de la lente: si la lente de inmersión en aceite es pegajosa, se utiliza un paño para lentes humedecido con metanol para limpiarlo.
- Si la lente está muy sucia, puede limpiarse con xilol, sin embargo, el procedimiento de limpieza con xilol solo debe ser realizado solo si es necesario. El uso constante de xilol puede aflojar la lente.
Se deben seguir los siguientes procedimientos de rutina para asegurar el uso correcto y eficiente del microscopio mientras se enfoca.
- Coloque el portaobjetos del microscopio con la muestra dentro de los clips de la platina en el escenario fijo. Se mueve la diapositiva para centrar la muestra sobre la abertura en la platina directamente sobre la fuente de luz.
- Girar la lente de escaneo o la lente de baja potencia en su posición. Mientras se mira desde un lado para asegurarse de que la lente no toque la muestra, se gira la perilla de enfoque grueso para mover la platina lo más cerca posible del objetivo sin tocar la lente.
- Mientras se mira a través de la lente ocular, se gira la perilla de enfoque grueso con cuidado, y lentamente mueva la platina lejos de la lente hasta que la muestra quede fuera de foco. Luego, se usa la perilla de enfoque fino para enfocar bien la muestra.
- Regularmente se debe ajustar la fuente de luz por medio de la configuración del transformador de fuente de luz, y el diafragma del iris, para una iluminación óptima para cada nueva diapositiva y para cada cambio en la ampliación.
- Una vez que se haya enfocado bien el espécimen con una lente de baja potencia, se puede preparar para visualizar el espécimen bajo inmersión en aceite. Se coloca una gota de aceite en la diapositiva directamente sobre el área a ser vista. Gire el revólver hasta que el objetivo de inmersión en aceite quede bloqueado en su posición.
- Durante el examen microscópico de organismos microbianos, siempre es necesario observar varias áreas de la preparación. Esto se logra escaneando la diapositiva sin la aplicación de aceite de inmersión adicional.
