La PCR es una técnica utilizada en el laboratorio para hacer millones de copias de una sección particular de ADN. Fue desarrollado por primera vez en la década de 1980.
¿Qué es PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en ingles), fue desarrollada originalmente en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis. Fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1993 por su trabajo pionero.
La PCR se utiliza en biología molecular para hacer muchas copias de (amplificar) pequeñas secciones de ADN o de un gen.
Usando PCR es posible generar miles o millones de copias de una sección particular de ADN a partir de una cantidad muy pequeña de ADN.
La PCR es una herramienta común utilizada en laboratorios de investigación médica y biológica. Se utiliza en las primeras etapas del procesamiento del ADN para la secuenciación, para detectar la presencia o ausencia de un gen que ayuda a identificar los patógenos durante la infección y al generar perfiles de ADN forense a partir de pequeñas muestras de ADN.
¿Cómo funciona la reacción en cadena de la polimerasa?
Los principios detrás de cada reacción en cadena de la polimerasa, cualquiera que sea la muestra de ADN, son los mismos. Se requieren cinco «ingredientes» centrales para establecer una PCR. Explicaremos exactamente qué hace cada uno de ellos a medida que avanzamos.
Estos son:
- La plantilla de ADN que se va a copiar.
- Cebadores, tramos cortos de ADN que inician la reacción de PCR, diseñados para unirse a cualquier lado de la sección de ADN que desea copiar.
- Bases de nucleótidos de ADN (también conocido como dNTPs). Las bases de ADN (A, C, G y T) son los componentes básicos del ADN y se necesitan para construir la nueva cadena de ADN.
- Enzima Taq polimerasa para agregar en las nuevas bases de ADN buffer para garantizar las condiciones adecuadas para la reacción.
- La PCR implica un proceso de calentamiento y enfriamiento llamado ciclado térmico que se lleva a cabo por máquina.
Hay tres etapas principales
Desnaturalización:
Cuando el ADN molde de doble cadena se calienta para separarlo en dos cadenas simples.
Recocido:
Cuando se baja la temperatura para permitir que los cebadores de ADN se unan al ADN molde.
Extensión:
Cuando la temperatura aumenta y la nueva cadena de ADN es producida por la enzima Taq polimerasa. Estas tres etapas se repiten de 20 a 40 veces, duplicando el número de copias de ADN cada vez.
Se puede realizar una reacción de PCR completa en unas pocas horas, o incluso menos de una hora, con ciertas máquinas de alta velocidad.
Una vez completada la PCR, se puede usar un método llamado electroforesis para verificar la cantidad y el tamaño de los fragmentos de ADN producidos.
¿Qué sucede en cada etapa de la PCR?
Etapa de desnaturalización:
Durante esta etapa, el cóctel que contiene el ADN molde y todos los demás ingredientes centrales se calienta a 94-95⁰C. La alta temperatura causa los enlaces de hidrógeno entre las bases en dos cadenas de ADN molde para romper y las dos cadenas para separar.
Esto da como resultado dos cadenas simples de ADN, que actuarán como plantillas para la producción de las nuevas cadenas de ADN. Es importante que la temperatura se mantenga en esta etapa el tiempo suficiente para garantizar que las hebras de ADN se hayan separado por completo.
Esto generalmente toma entre 15-30 segundos.
Etapa de recocido:
Durante esta etapa, la reacción se enfría a 50-65ºC. Esto permite que los cebadores se adhieran a una ubicación específica en el ADN molde monocatenario por medio de enlaces de hidrógeno (la temperatura exacta depende de la temperatura de fusión de los cebadores que está utilizando).
Los cebadores son cadenas simples de ADN o ARN, los cuales son alrededor de 20 a 30 bases de longitud. Los primeros están diseñados para ser complementarios en secuencia a secciones cortas de ADN en cada extremo de la secuencia que se va a copiar.
Los iniciadores sirven como punto de partida para la síntesis de ADN. La enzima polimerasa solo puede agregar bases de ADN a una doble cadena de ADN. Solo una vez que el cebador se ha unido, la enzima polimerasa se une y comienza a formar las nuevas cadenas complementarias de ADN a partir de las bases de ADN sueltas.
Las dos hebras separadas de ADN son complementarias y corren en direcciones opuestas (de un extremo – el extremo 5 ‘al otro – el extremo 3’); como resultado, hay dos cebadores: un cebador directo y un cebador inverso.
Este paso por lo general toma alrededor de 10-30 segundos.
Etapa de extensión:
Durante este paso final, el calor se incrementa a 72 ° C para permitir que el nuevo ADN se fabrique mediante una enzima Taq DNA polimerasa especial que agrega bases de ADN.
Taq ADN polimerasa es una enzima tomada de las bacterias amantes del calor. Esta bacteria normalmente vive en aguas termales, por lo que puede tolerar temperaturas superiores a 80 ° C.
La ADN polimerasa de las bacterias es muy estable a altas temperaturas, lo que significa que puede resistir las temperaturas necesarias para separar las hebras de ADN en la etapa de desnaturalización de la PCR.
La ADN polimerasa de la mayoría de los otros organismos no podría resistir estas altas temperaturas, por ejemplo, la polimerasa humana funciona idealmente a 37 ° C (temperatura corporal). 72⁰C es la temperatura óptima para que la polimerasa Taq construya la cadena complementaria.
Se une al cebador y luego agrega bases de ADN a la cadena individual una a una en la dirección de 5 ‘a 3’.
El resultado es una nueva cadena de ADN y una molécula de ADN de doble cadena. La duración de este paso depende de la longitud de la secuencia de ADN que se amplifica, pero por lo general toma alrededor de un minuto copiar 1,000 bases de ADN (1Kb).
Estos tres procesos de ciclo térmico se repiten 20-40 veces para producir muchas copias de la secuencia de ADN de interés. Los nuevos fragmentos de ADN que se producen durante la PCR también sirven como plantillas a las que la enzima ADN polimerasa se puede unir y comenzar a producir ADN.
El resultado es una gran cantidad de copias del segmento de ADN específico producido en un período de tiempo relativamente corto.
